CRISPR는 3세대 유전자 편집 기술입니다. CRISPR는 세상을 혁신했습니다.

규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복 서열(CRISPR)은 높은 처리량으로 세상을 혁신시킨 3세대 유전자 편집 기술입니다. 이 기술은 다양한 생물학적 질병 및 감염 치료에 사용되어 왔습니다. 다양한 박테리아와 기타 원핵생물(예: 고세균) 또한 파지에 대한 방어 기작으로 CRISPR/Cas9 시스템을 가지고 있습니다. CRISPR/Cas9 기반 전략은 잠재적으로 변형된 내성 유전자, 전사 및 후성유전적 조절을 표적으로 삼아 삼중 음성 유방암(TNBC)의 성장과 진행을 억제할 수 있다는 보고가 있습니다. 이러한 치료법은 TNBC에서도 관찰되는 약물 내성과 같은 난제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 현재 CRISPR/Cas9를 표적 세포에 전달하는 방법에는 물리적 방법(미세주입, 전기천공법 및 유체역학적 방법), 바이러스성 방법(아데노 관련 바이러스 및 렌티바이러스) 및 비바이러스성 방법(리포솜 및 지질 나노입자) 등 다양한 방법이 사용되고 있습니다. 삼중음성 유방암(TNBC)의 분자적 원인을 연구하기 위해 다양한 모델이 개발되었지만, 생체 내에서 유전자 편집 도구를 전달하는 민감하고 표적화된 방법의 부족으로 임상 적용이 제한적입니다. 본 리뷰에서는 기존 연구 결과를 바탕으로 TNBC에 대한 CRISPR/Cas9 치료의 진행 상황, 과제, 한계 및 전망을 종합적으로 검토합니다. 또한 인공지능과 머신러닝의 결합이 TNBC 치료에서 CRISPR/Cas9 전략을 어떻게 개선할 수 있는지에 대해서도 강조합니다.
암은 조절되지 않는 세포 분열, 세포 주기 검문점의 교란, 그리고 종양 억제 유전자(TSG)의 돌연변이를 특징으로 합니다(Matthews et al., 2022). 다양한 암 유형 중 유방암은 여성에게 가장 흔한 암이며 전 세계적으로 사망률이 높습니다(Waks and Winer, 2019). 유방암은 조직학적 및 생물학적 특징, 임상 양상 및 진행 양상, 치료 반응 등 다양한 특성을 지닌 이질적인 질환입니다(Weigelt et al., 2010). 유방암 분류는 유방암 진단 및 종양 예후에 대한 정확한 정보를 제공합니다. 일반적인 생체 표지자와 임상병리학적 특징의 활용은 유방암 분류의 주요 기준이 되어 왔습니다(Tsang and Tse, 2019). 유방암의 예후와 치료 반응은 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR), 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2/neu)의 존재 여부, 조직학적 등급, 종양 유형 및 크기, 림프절 전이 등 여러 요인의 영향을 받습니다(Al-Tubaiti, 2020). 유방암은 루미널 A, 루미널 B, HER2-enriched, 기저세포형, 클라우딘-low의 다섯 가지 고유한 분자 아형으로 분류됩니다(Prat et al., 2015). 삼중 음성 유방암(TNBC)은 ER, PR, HER2를 모두 발현하지 않는 암의 분자 아형입니다(Yin et al., 2020). 이러한 병리학적 특징은 TNBC와 관련되어 있으며, 다른 유형의 유방암보다 빠른 진행과 공격적인 특성을 나타냅니다(Feng et al., 2018). 또한, Peru et al(2000)은 마이크로어레이 기술을 이용하여 유방암을 재분류하고 5가지 고유한 아형을 식별했습니다(Cadenas, 2012). 기저세포형 유방암은 삼중 음성 표현형을 가지며 빠른 진행과 관련이 있는 유방암의 아형입니다. 모든 기저세포형 유방암이 삼중 음성 유방암으로 오진되는 경우가 흔하지만, 실제로 삼중 음성인 경우는 77%에 불과합니다. 반면, 삼중 음성 유방암의 71~91%는 기저세포형 유방암으로, 이 두 유형의 유방암이 중복되면서도 서로 다른 분류를 나타낸다는 점에 주목해야 합니다(Wang D.-Y. et al., 2019). 따라서 삼중 음성 유방암의 이질성을 규명하여 예후를 밝히고 현재 및 미래 치료법에 대한 잠재적 반응을 파악하는 것이 중요합니다. 또한, 삼중 음성 유방암은 전체 유방암 사례의 15~20%를 차지하며 50세 미만 여성에게 더 흔합니다. BRCA1 또는 BRCA2 유전자 변이는 삼중 음성 유방암(TNBC) 환자의 약 20%에서 보고되었습니다(Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). 또한, 연구에 따르면 TNBC는 혈관 내피 성장 인자, 종양 관련 대식세포(TAM), 종양 침윤 림프구(TIL) 및 종양 성장과 전이에 관여하는 기타 분자들이 높은 수준으로 존재하는 독특한 면역 미세환경을 가지고 있습니다. 따라서 TNBC의 미세환경을 이해하는 것은 예후 및 치료에 매우 중요합니다(Fan and He, 2022).
삼중음성 유방암(TNBC)의 예후를 평가하고 효과적인 치료를 위해서는 정확한 진단이 필수적입니다. 진단은 주로 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR), HER2를 검출하는 면역조직화학(IHC) 검사와 유방 종양을 발견하는 유방촬영술에 기반합니다. 그러나 유방촬영술은 괴사 및 섬유화와 같은 종양 내 특징을 충분히 보여주지 못합니다(Deepak Singh et al., 2021). 좋지 않은 예후와 정확한 진단은 의료진이 적절한 약물을 처방하는 것을 어렵게 합니다(Chaudhary, 2020). 따라서 TNBC 환자 치료를 개선하기 위해 다양한 전략이 사용되고 있습니다. 현재 TNBC 환자에게는 독소루비신과 사이클로포스파미드 두 가지 약물이 사용되고 있으며, 좋은 결과를 보여주고 있습니다. 이 외에도 카보플라틴, 시스플라틴과 같은 다른 백금계 항암제도 사용되고 있습니다(Sikov et al., 2015). 또한, 올라파립, 벨라파립, PF-01367338과 같은 PARP 억제제는 삼중음성 유방암(TNBC) 치료를 위한 잠재적인 항암화학요법제로 사용되어 왔습니다(Ishino et al., 2018). Wnt/β-카테닌, NOTCH, Hedgehog 신호전달 경로가 TNBC의 발생 및 진행에 관여하는 것으로 보고되었으므로, 이러한 경로를 표적으로 하는 약물 개발이 중요한 전략이 될 수 있습니다(Aysola et al., 2013). 현재 수술, 방사선 치료, 항암화학요법이 TNBC 치료의 주요 방법으로 남아 있지만, 표적 치료, 면역 치료, Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, 프라임 편집, CRISPR/Cas9 표적 유전자 치료와 같은 다양한 CRISPR 관련 유전자 편집 도구를 포함한 새로운 치료법 개발에 상당한 진전이 이루어졌습니다. 본 논문에서는 TNBC 치료에 사용되는 다양한 CRISPR 관련 유전자 편집 도구에 대해 중점적으로 살펴볼 것입니다. 그중에서도 CRISPR/Cas9는 광범위한 주목을 받고 있다.
Cas9n(Cas9 니카제라고도 함)은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템에서 유래한 Cas9 단백질의 유전적으로 변형된 변이체입니다(Gupta et al., 2019). 원래 Cas9 단백질은 RuvC와 HNH라는 두 개의 뉴클레아제 도메인을 가지고 있으며, 이 도메인들의 주요 기능은 양쪽 DNA 가닥을 모두 절단하는 것입니다. 그러나 Cas9n에서는 이 뉴클레아제 도메인 중 하나인 HNH가 유전적으로 변이되어 비활성화됩니다. 따라서 Cas9n의 HNH 도메인은 기능을 하지 못합니다. RuvC 도메인만 활성을 유지하여 Cas9n은 단일 DNA 가닥을 절단하거나 특정 위치에 절단 부위를 생성할 수 있습니다(Trevino and Zhang, 2014). Cas9와 비교했을 때, Cas9n은 표적 외 효과를 효과적으로 줄이고 세포 복구 메커니즘을 더욱 정확하게 개선할 수 있습니다. Cas9n은 이중 가닥 DNA의 특정 위치에 절단 부위를 생성하는 것과 같은 다양한 문제를 해결하는 데 활용될 수 있습니다. 이를 위해 두 개의 Cas9n 분자를 결합하여 함께 사용했습니다(Yee, 2016). 혼합 계통 키나제 3(MLK3)은 TNBC 전이 과정에서 핵심 조절자 역할을 하는 미토겐 활성화 단백질 키나제입니다(Cronan et al., 2012).
MLK3는 삼중 음성 유방암(TNBC) 전이를 유도하는 여러 신호 전달 경로를 활성화할 수 있습니다. 예를 들어, c-Jun N-말단 키나제(JNK) 경로는 세포 이동성과 세포외 기질(ECM) 분해를 조절하는데, MLK3는 JNK 경로를 활성화하여 세포 이동성을 증가시키고 침습성을 부여합니다(Rattanasinchai and Gallo, 2016). MLK3는 또한 상피-간엽 전환(EMT)을 조절합니다. 이를 위해 MLK3는 Snail, Slug, Twist와 같은 하위 전사 인자를 활성화합니다. 이러한 인자들은 상피 표지자의 발현을 억제하고 간엽 표지자의 발현을 촉진하여 전이성 표현형 획득을 유도합니다(Casalino et al., 2023). MLK3는 ECM 리모델링 및 ECM을 분해하는 기질 금속단백분해효소(MMP)와 같은 단백분해효소 활성화에도 관여하는 것으로 관찰되었습니다. 이는 종양 세포의 침습 및 원격 전이를 촉진합니다(Katari et al., 2019). 따라서 이전 연구들은 MLK3가 삼중음성 유방암(TNBC)에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. Rattanasinchai와 Gallo는 TNBC 모델을 사용하여 MLK3의 역할을 연구했고, MLK3가 특정 신호 전달 경로를 통해 암 발달을 촉진한다는 것을 발견했습니다. 그들은 CRISPR/Cas9n을 이용하여 MLK3를 편집했고, TNBC 전이가 현저하게 감소하는 것을 관찰했습니다(Rattanasinchai and Gallo, 2016).
dCas9(비활성 Cas9)는 Cas9 단백질의 변형 유도체입니다. 활성 Cas9와 달리 dCas9는 엔도뉴클레아제 활성이 없어 DNA 이중 가닥 절단을 유도할 수 없습니다. 따라서 dCas9는 DNA 서열을 변경하거나 수정하지 않고도 게놈의 특정 영역을 정밀하게 표적화하는 데 사용할 수 있습니다(Wang et al., 2016). dCas9에서는 RuvC와 HNH라는 두 개의 엔도뉴클레아제 단백질이 중요한 아미노산 잔기의 발현을 억제함으로써 비활성화됩니다(Richter et al., 2016). DNA 절단 활성이 없음에도 불구하고 dCas9는 유전 연구 및 생명 공학 분야에서 여러 중요한 역할을 수행합니다. 예를 들어, 게놈의 특정 영역을 시각화하고, 전사 조절을 용이하게 하며, 후성 유전적 변형을 촉진합니다(Brocken et al., 2018).
전사 인자 ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)은 배아 발달, 조직 복구 및 암 진행 과정에서 발생하는 세포 과정인 상피-간엽 전환(EMT)을 매개하는 데 특정한 핵심적인 역할을 합니다. EMT는 상피 세포가 간엽 세포로 변형되는 과정으로, 세포 형태, 운동성, 침윤성 등의 변화를 초래합니다(Wu et al., 2020). ZEB1은 삼중 음성 유방암(TNBC)에서 상피 세포의 세포 간 접착 및 극성 유지에 관여하는 E-cadherin 및 Occludin과 같은 여러 상피 표지자를 억제합니다(Moreno-Bueno et al., 2008). 또한, ZEB1은 N-카드헤린, 비멘틴, 피브로넥틴과 같은 특정 마커를 활성화시키고(Konradi et al., 2014), Rho GTPase 및 기질 금속단백분해효소(MMP)와 같은 세포골격 재구성 관련 유전자를 조절합니다(Huang et al., 2014, 2022). 뿐만 아니라, 형질전환 성장인자-β(TGF-β), Wnt 신호전달 등 다양한 신호전달 경로에 영향을 미쳐 삼중음성 유방암(TNBC)에서 종양 침윤 및 전이를 촉진합니다(Chen et al., 2016). 수많은 연구와 과학적 증거는 ZEB1이 TNBC의 진단 및 치료에 유용한 인자로서 큰 잠재력을 가지고 있음을 보여줍니다. 최근 Waryah et al.은 TNBC 모델을 사용하여 dCas9를 통해 ZEB1의 완전한 억제를 달성했습니다. 따라서 그들은 생체 내 조건에서 ZEB1의 매우 높은 특이성과 거의 완벽한 억제를 관찰했습니다(Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12는 CRISPR/Cpf1이라고도 불리는 유전자 편집 도구입니다. 이는 CRISPR/Cas 시스템에서 유래되었으며, Cas12는 CRISPR 관련 단백질 12(CRISPR-associated protein 12)를 의미합니다(Bharathkumar et al., 2022). Cas12는 Cas9와 구조적으로 매우 유사하며, Cas12 단백질을 포함하고 있다는 점만 다릅니다. Cas9와 비교했을 때, Cas12는 유전자 편집 과정에서 점착성 말단(sticky ends)을 생성하는 반면, Cas9는 무딘 말단(blunt ends)을 생성하는 등 몇 가지 고유한 기능을 가지고 있습니다(Wang et al., 2021). 이러한 Cas12의 특성은 특정 DNA를 정밀하게 조작하는 기술에 기여합니다. 표적 DNA를 정확하게 인식하고 절단할 수 있는 단백질로서, Cas12는 탁월한 활용성을 지니고 있어 유전자 편집을 포함한 다양한 응용 분야에서 효과적인 도구로 사용될 수 있습니다(Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
다른 CRISPR 변형과 마찬가지로 CRISPR/Cas12 또한 삼중 음성 유방암(TNBC)에서 유전자를 억제하거나 활성화할 수 있으며, TNBC의 발병기전이나 치료 반응에 중요한 역할을 하는 유전자를 표적으로 삼습니다(Yang and Zhang, 2023). 이를 위해 Cas12를 표적 유전자로 유도하는 가이드 RNA(gRNA)가 개발되었습니다. Cas12가 표적에 결합하면 DNA에 이중 가닥 절단을 유도하고 DNA 복구 메커니즘을 활성화합니다. 복구 과정에서 잘못된 뉴클레오티드가 삽입되어 유전자 돌연변이 및 기능 상실을 초래할 수 있습니다(Zhang et al., 2021a). 또한, 개선된 Cas12 효소(dCas12)도 유전자 활성화에 사용됩니다. 이를 전사 활성인자와 결합하면 특정 유전자의 발현을 유도하여 활성화할 수 있습니다. 이 기술은 종양 억제 유전자의 활성화를 촉진하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다(Sultan et al., 2022).
프라이머 편집은 새롭게 개발된 매우 우수한 유전자 편집 기술입니다. 이 기술은 생물체의 DNA를 매우 정밀하게 변형할 수 있습니다(Chen and Liu, 2023). 프라이머 편집은 변형된 CRISPR/Cas9 효소와 역전사효소라는 두 가지 주요 구성 요소의 결합을 통해 이루어집니다. CRISPR/Cas9 효소는 게놈 내 특정 부위를 선택적으로 표적화하는 역할을 하며, 역전사효소는 표적 위치의 DNA를 철저하게 변형하는 데 도움을 줍니다(Hassan et al., 2021). 프라이머 편집 메커니즘에서 첫 번째 단계는 프라이머 편집 가이드 RNA(pegRNA)를 생성하는 것입니다(Standage-Beier et al., 2021). 이 pegRNA는 표적 DNA에서 원하는 편집 부위에 해당하는 표적 서열과 RNA 템플릿을 포함합니다. 그런 다음 pegRNA는 프라이머 편집 뉴클레아제(PE2)와 함께 표적 세포에 도입됩니다. PE2는 Cas9 효소, 역전사효소 및 프라이머 편집 어댑터로 구성된 융합 단백질입니다(Martín-Alonso et al., 2021). 세포 내에서 pegRNA와 PE2 복합체는 변형하고자 하는 특정 DNA를 찾습니다. Cas9 효소는 DNA를 절단하여 단일 가닥으로 구성된 주형을 생성합니다(Choi et al., 2022). 역전사효소는 이 주형을 사용하여 DNA 편집을 위한 준비를 합니다. DNA 복제와 함께 RNA 주형 편집에 필요한 지침도 포함됩니다. 마지막으로, 새로 생성된 DNA 가닥은 DNA 절단 부위를 복구하는 주형으로 사용되어 원하는 변형이 포함된 변형된 DNA 서열을 생성합니다(Ochoa-Sanchez et al., 2021). 프라이머 편집 메커니즘은 유전자에서 광범위한 돌연변이를 유발할 수 있습니다. 점 돌연변이, 삽입, 삭제, 심지어 유전자 치환까지 표적화할 수 있습니다(Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). 프라이머 편집은 기존의 유전자 편집 기술에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 이러한 장점에는 정확도 향상, 비표적 효과 감소, DNA 이중 가닥 절단에 의존하지 않고 DNA를 편집할 수 있는 능력 등이 있습니다(Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9 기술은 원래 플라스미드 전이 및 파지 감염으로부터 박테리아를 보호하기 위해 개발되었으며, 이후 유전자 편집을 위한 효과적인 RNA 기반 DNA 표적화 도구로 용도가 변경되었습니다(Jiang and Doudna, 2017). 또한, CRISPR/Cas9 시스템은 박테리아 게놈의 50%, 고세균 게놈의 87%에서 발견되는 것으로 보고되었습니다(Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9는 생체 내외에서 비정상적인 유전자 서열을 삭제, 삽입 및 교정할 수 있는 잠재력을 지닌 도구입니다(Sabit et al., 2021). 더욱이, CRISPR/Cas9는 특정 표적 유전자에 대한 특이성으로 인해 적응 면역 체계의 일부로 작용하는 것으로 밝혀졌습니다(Chen and Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9 단백질과 단일 가이드 RNA(sgRNA)로 구성됩니다. Cas9는 여러 단백질 구성 요소로 이루어진 엔도뉴클레아제입니다. 또한 Cas9는 인식 영역(REC)과 뉴클레아제 영역(NUC)의 두 부분으로 구성되어 있어 독특한 구조적 및 형태적 특성을 지닙니다(Pacesa et al., 2022). REC 영역은 REC1, REC2, 그리고 브리지 헬릭스의 세 영역으로 나뉩니다(Cromwell et al., 2018). NUC 영역은 RuvC(RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH, 그리고 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 상호작용 도메인의 세 부분으로 구성됩니다(그림 1)(Song et al., 2016). sgRNA는 CRISPR RNA(crRNA)와 전사 소형 RNA(추적 RNA)의 두 가지 구성 요소로 이루어져 있습니다(그림 1). sgRNA는 Cas9 단백질을 커넥신과 연결하여 활성 복합체, 즉 이펙터 복합체를 형성합니다(Richter et al., 2012). crRNA는 18~20개의 뉴클레오티드로 구성된 염기쌍으로, 표적 DNA 서열을 인식하는 데 중요한 역할을 합니다. 또한, crRNA는 표적 DNA와 결합하고, tracrRNA는 Cas9 뉴클레아제가 표적 DNA에 결합할 수 있도록 지지대 역할을 합니다(Manghwar et al., 2019). 한편, PAM 서열은 3개의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 이펙터 복합체와 DNA의 결합을 확인, 특정 및 매개합니다. Cas9 단백질 복합체의 소단위인 RuvC와 HNH는 촉매 활성을 가지고 있습니다(Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). Cas9 소단위의 HNH 뉴클레아제 도메인은 crRNA와 결합된 DNA 가닥을 절단합니다. RuvC 뉴클레아제 도메인은 다른 DNA 가닥을 절단하고 이중 가닥 파손(DSB)을 생성한 후 두 가지 다른 DNA 파손 복구 메커니즘이 활성화됩니다(Jiang 및 Doudna, 2017)(그림 1).
그림 1. CRISPR/Cas9 개요 (A). CRISPR/Cas9 시스템의 구성 요소: (i) Cas9 엔도뉴클레아제는 표적 DNA 서열을 절단하는 역할을 한다. (ii) crRNA와 tra-crRNA 키메라의 융합으로 생성된 단일 가이드(sg) RNA. (2) Cas9는 Rec I, Rec II, NUC 로브(HNH와 Ruv C는 하위 구성 요소임), PAM 상호작용 도메인(C) 등 여러 구성 요소로 이루어져 있으며 각각 고유한 기능을 수행한다. CRISPR/Cas9 단백질 복합체는 DNA 서열을 비상보적 형태와 상보적 형태로 절단한다(D). CRISPR/Cas9는 인식, 절단, 복구의 세 단계를 거쳐 게놈을 편집한다. 설계된 sg-RNA는 Cas9를 유도하고 상보적 구성 요소인 crRNA를 통해 원하는 서열을 인식한다. Cas9는 5'-NGG-3' 위치의 PAM 서열을 인식하고 DNA를 절단하여 DNA-RNA 하이브리드를 형성하고 절단 반응을 활성화한다. Cas9의 HNH 도메인은 상보적 가닥을 절단하고, RuvC 도메인은 비상보적 가닥을 절단합니다. CRISPR/Cas9는 비상동 말단 접합(NHEJ)과 상동성 유도 복구(HDR)라는 두 가지 방식으로 이중 가닥 DNA를 복구합니다. NHEJ는 외부 상동 DNA가 없는 상태에서 효소적 과정을 통해 이중 가닥 DNA를 복구하는데, 이는 임의의 DNA 서열을 삽입하거나 제거할 수 있는 오류 발생 가능성이 높은 메커니즘입니다. HDR은 매우 특이적이며 상동 DNA 주형을 필요로 합니다.
CRISPR/Cas9 매개 복구 경로는 비상동 말단 접합(NHEJ) 및 상동성 유도 복구(HDR) 메커니즘을 포함합니다. NHEJ는 삽입 또는 삭제를 수반하고 복구 과정에서 특정 패턴을 요구하지 않기 때문에 오류 발생 가능성이 높은 경로입니다. 이 경로는 무작위 뉴클레오티드를 사용하여 표준 단백질을 생성합니다(Abbasi et al., 2021). 이 복구 시스템은 KU 복합체, 교차 보완 단백질 복합체 유형 4(XRCC-4), DNA 말단 처리 효소 및 단백질 키나아제 DNA-PKcs와 같은 네 가지 복합체로 구성됩니다(Abbasi et al., 2021). KU 복합 단백질은 Ku 70과 Ku 80의 두 소단위로 구성되어 있으며, NHEJ(비상동 말단 접합) 메커니즘에서 중요한 역할을 합니다. 복구 메커니즘은 두 소단위(Ku 70과 Ku 80)가 표적 DNA의 무딘 말단 또는 거의 무딘 말단에 결합함으로써 시작되며(Abbasi et al., 2021), 손상 부위로 다른 NHEJ 관련 인자들을 모집하는 발판 역할을 합니다(Yang et al., 2020). XRCC-4와 DNA 리가아제는 각각 334개와 911개의 아미노산으로 구성되어 있으며, XRCC4-DNA 리가아제 IV 복합체는 DNA 말단 연결을 촉진합니다(Chatterjee et al., 2015). 폴리뉴클레오티드 키나아제 3'-인산으로도 알려진 DNA 말단 처리 효소는 이중 가닥 파손(DSB) 복구 과정에서 DNA의 3'P기를 제거하고 5'OH기를 인산화합니다. 또한, 단일 가닥 파손(SSB) 복구 경로를 이용한 단일 가닥 파손(SSB) 복구도 포함됩니다(Chatterjee et al., 2015). 단백질 키나아제 DNA-PKcs는 PIKK(포스파티딜이노시톨 3-키나아제 관련 키나아제) 및 ATM(운동실조증-모세혈관확장증 돌연변이) 계열의 촉매 소단위와 ATM 및 Rad3 관련 ATR로 구성된 DNA 의존성 단백질 키나아제입니다. 이중 가닥 파손(DSB) 및 단일 가닥 파손(SSB)을 복구합니다(Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR은 상동 DNA 이중가닥의 손상되지 않은 형태를 사용하여 정보를 복제하기 때문에 더 정확하고 적합한 복구 메커니즘이지만, 자매 염색체의 존재가 필요합니다. 이는 포유류 세포 주기의 S/G2 단계에서 발생합니다. HDR은 주로 효모에서 발생하지만, 포유류에서는 NHEJ가 중요합니다(Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). 전체 복구 메커니즘은 그림 1에 나와 있습니다.
삼중음성 유방암(TNBC)은 유전적 및 후성유전적 이상으로 인해 발생하므로, CRISPR/Cas9를 이용하여 악성 유전체/후성유전체 이상을 교정하는 것이 합리적인 치료 접근법이 될 수 있습니다(Chen et al., 2019). 또한, 세포 특이적 전사 조절에 관여하는 일부 전사 인자들은 암세포만의 고유한 특성을 나타낼 수 있으며, 이는 전사 조절이 암 치료에 효과적인 접근법이 될 수 있음을 시사합니다(Drost et al., 2017). 유전적, 후성유전적, 전사적 결함과 같은 종양의 이러한 분자적 특징을 활용한 신약 개발은 임상 결과를 개선하고 스크리닝 비용을 절감할 수 있습니다. CRISPR는 암을 유발하는 유전체 표적을 탐지하고 식별할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 세포에서 종양 유전자를 편집, 억제 및 후성유전적으로 변형하는 데에도 사용할 수 있는 잠재적인 유전자 편집 도구입니다(표 1)(Ahmed et al., 2021). 종양 억제 유전자, 종양 유전자 및 약물 내성과 관련된 유전자를 찾기 위해 여러 CRISPR 스크리닝 연구가 수행되었습니다. 그림 2는 CRISPR/Cas9를 이용하여 다양한 TNBC 종양유전자를 편집하는 방법을 보여줍니다.
그림 2. CRISPR/Cas9를 이용한 다양한 TNBC 종양 유전자의 유전자 편집으로 종양 성장 및 전이가 감소되었다. 이러한 종양 유전자에는 TNBC의 발생 및 전이에 관여하는 CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 및 CXCR7, Crypto1, ROR1 및 ST8SIA가 포함된다.
암세포의 이동, 침윤 및 상피-간엽 전환(EMT)은 ITGA9와 관련이 있습니다. 이전 연구에서는 ITGA9가 Notch 신호전달 경로의 핵심 인자이며 횡문근육종의 전이에 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀졌습니다(Molist et al., 2020). 또한, ITGA9는 유방암을 포함한 여러 종양 유형에서 환자의 예후와 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났습니다(Wang Z. et al., 2019). ITGA9에 대한 생물정보학 분석 결과, 삼중음성 유방암(TNBC)에서 ITGA9 발현이 다른 유방암 아형보다 유의하게 높은 것으로 나타났습니다. ITGA9 수치 증가는 TNBC 환자의 종양 전이 및 재발과 관련이 있습니다. CRISPR/Cas9를 이용한 ITGA9 녹아웃은 TNBC에서 β-catenin 분해를 촉진하여 암 줄기세포(CSC) 유사 특성, 종양 혈관 신생, 종양 성장 및 전이 감소를 유발하는 것으로 나타났습니다(Wang Z. et al., 2019).
크립토-1(Crypto-1)은 TGF-β 계열 단백질로, 초기 배아 발생, 줄기세포 유지 및 암 전이에 중요한 역할을 합니다(Ishii et al., 2021). Tdgf-1로도 알려진 크립토-1은 발암성 GPI 앵커 신호 단백질로, 배아 발생 과정에서 원시 줄기, 중배엽 및 내배엽 형성을 조절하고 신체 장기 발달의 좌우 비대칭성을 확립하는 데 관여합니다(Zhang et al., 2021b). 또한, 크립토-1은 줄기세포 표지자로서 상피-간엽 전환(EMT)에도 관여하는 것으로 밝혀졌습니다(Zhang et al., 2021b). EMT는 배아 발달, 섬유화 및 상처 치유와 같은 다양한 과정뿐만 아니라 암 침윤 및 전이에도 매우 중요합니다. 또한, 크립토-1은 4가지 노치 수용체와 상호작용하여 이들의 번역 후 성숙을 촉진하는 것으로 밝혀졌습니다(Brandstadter and Maillard, 2019). 노치 신호 전달 경로는 인간 유방암 세포의 유지에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 연구에 따르면 CRISPR/Cas9 매개 크립토-1 유전자 결손은 암 성장 및 전이를 억제합니다. 따라서 크립토-1은 삼중 음성 유방암(TNBC)의 중요한 치료 표적이 될 수 있습니다(Castro et al., 2015).
XCL12 단백질과 그 케모카인 수용체인 CXC(CXCR4 및 CXCR7)는 암세포의 증식, 성장, 이동 및 침윤에 다양한 역할을 합니다(Wu et al., 2015). 이러한 화학수용체는 생체 내외 모델 모두에서 다양한 신호 전달 경로를 통해 삼중음성 유방암(TNBC)의 발병과 관련이 있는 것으로 알려져 있습니다(Wu et al., 2015). 또한, CXCR4와 CXCR7의 활성화는 TNBC에서 전이에 대한 감수성 증가 및 불량한 예후와 관련이 있습니다(Karn et al., 2022). 따라서 CXCR4와 CXCR7의 녹아웃은 TNBC를 포함한 유방암 치료를 위한 효과적인 약물 표적 유전자가 될 수 있습니다. Yang et al.의 연구에 따르면... Yang et al(2019)은 CRISPR/Cas9를 사용하여 CXCR4 및 CXCR7 유전자를 동시에 녹아웃시켰고 TNBC의 증식, 성장, 이동 및 침습이 크게 억제되었음을 발견했습니다(Yang et al., 2019).
TNBC 종양유전자인 miR-3662의 발현 수준이 유방암 조직에서 증가된 것이 관찰되었습니다(Yi et al., 2022). miR-3662의 발현 억제는 생체 내외에서 유방암 종양 성장 및 전이를 억제하는 것으로 나타났습니다(Agarwal and Gupta, 2021). HBP-1은 Wnt/β-catenin 신호전달의 강력한 억제제이며, miR-3662에 의해 매개되는 TNBC 세포 성장에 관여하는 것으로 추정됩니다. 최근 Yi et al.은 miR-3662-HBP1 축이 TNBC 세포에서 Wnt/β-catenin 신호전달 경로를 조절한다는 사실을 발견했습니다(Yi et al., 2022). 종양 특이적 발현을 보이는 miR-3662는 TNBC 치료를 위한 잠재적인 치료 표적이 될 수 있습니다. 따라서 CRISPR/Cas9를 이용한 miR-3662 발현 억제는 TNBC 치료를 위한 새로운 약물 개발에 효과적인 접근법이 될 수 있습니다.
UBR5는 300kDa 크기의 뉴클레오포스포단백질로, 다양한 암에서 종양 발생, 전이 및 면역 반응의 핵심 조절자로 알려져 있습니다(Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). UBR5는 삼중음성 유방암(TNBC) 샘플에서 발현이 크게 증가되어 있으며, 유비퀴틴 리가아제 활성을 통해 세포 증식을 유도함으로써 에스트로겐 수용체 알파(ERα) 기능을 자극하는 것으로 보고되었습니다(Bolt et al., 2015). 원발성 TNBC 샘플에 대한 전체 엑솜 시퀀싱 연구에서도 UBR5 발현 증가가 확인되어 TNBC 발병에 UBR5가 관여함을 시사합니다. 또한, CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용한 UBR5 유전자 삭제는 실험용 마우스 모델에서 TNBC의 전이 및 성장을 유의하게 억제했습니다. 더욱이, 야생형 마우스 모델에 UBR5를 도입하면 기능이 완전히 회복되었지만, UBR5가 불활성화된 돌연변이 계통에서는 이러한 효과가 관찰되지 않았습니다(Liao et al., 2017). UBR5 결핍은 불량한 혈관신생으로 인해 삼중음성 유방암(TNBC)에서 세포자멸사, 괴사 증가 및 종양 성장 억제와 관련이 있습니다. UBR5 소실로 인해 종양의 원격 전이가 감소하며, UBR5는 주로 E-cadherin 발현 감소를 통해 비정상적인 상피-간엽 전환(EMT)을 유도합니다(Zhang and Weinberg, 2018). 최근 연구에서는 UBR5가 E3 유비퀴틴화 활성 결핍으로 인해 TNBC에서 IFN-γ 유도 PDL1 전사에 매우 중요한 인자임이 밝혀졌습니다. RNA 전사체 분석 결과, UBR5는 IFN-γ 경로와 관련된 유전자들에 전신적인 영향을 미치고, 단백질 키나제 RNA(PKR) 및 신호 전달 및 활성화 인자 1(STAT1), 인터페론 조절 인자 1(IRF1)의 활성화 수준을 증가시켜 PDL1 전사 활성화를 촉진할 수 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 CRISPR/Cas9를 이용한 UBR5와 PD-L1 발현의 동시 억제는 각각의 억제보다 시너지 효과를 나타내며, 종양 미세환경에 상당한 영향을 미친다(Wu et al., 2022). 따라서 CRISPR/Cas9는 UBR5 기능을 억제하여 삼중음성 유방암(TNBC)의 전이 및 종양 성장을 억제하는 중요한 도구가 될 수 있다.
ROR1은 암 및 배아 발달 과정에서 발현되는 제1형 막관통 단백질로, 종양태아 단백질(oncofetal protein)로 알려져 있습니다(Nicholas Borcherding, 2014). 다양한 인간 암의 침습적 행동은 ROR1의 상향 조절과 관련이 있습니다. ROR1을 표적으로 하는 치료 화합물을 이용한 생체 내외 연구에서 유망한 결과가 얻어졌습니다(Chien et al., 2016). 유방 조직 생검에서 ROR1 mRNA 수치가 증가된 것은 공격적인 기저세포형 유방암(BL) 및 이 종양의 다른 신체 부위로의 전이와도 관련이 있습니다. 더욱이, ROR1의 과발현은 삼중음성 유방암(TNBC) 발생의 예후 지표로 확인되었습니다(Chien et al., 2016). 따라서 CRISPR/Cas9를 이용하여 ROR1을 억제하는 것은 TNBC의 성장과 전이를 억제하는 효과적인 전략이 될 수 있습니다.
시알릴화 과정은 시알릴전달효소(ST)에 의해 촉매되는 당접합체에 시알산이 첨가되는 과정입니다. ST8SIA1은 ST 계열에 속하며 림프구성 백혈병 및 대장암과 같은 다양한 질병의 병인에 중요한 역할을 합니다(Chang et al., 2018). RNA 서열 분석 결과, ST8SIA1은 삼중 음성 유방암(TNBC) 환자의 유방 조직에서 높은 발현량을 보이며, 종양 억제 유전자 p53의 돌연변이와 양의 상관관계를 나타내어 TNBC 발병에 기여할 수 있음을 시사합니다(Battula et al., 2017). 또한, ST8SIA1은 TNBC의 전이 및 재발에도 관여하여 TNBC의 발생 및 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. TNBC의 시험관 내 모델에서 CRIPSR/Cas9를 이용한 ST8SIA1 발현 억제는 종양 성장 및 전이를 차단하는 것으로 확인되었습니다(Battula et al., 2017). 이는 CRISPR/Cas9가 삼중음성 유방암 치료에서 ST8SIA1 종양유전자의 기능을 억제하는 데 중요한 도구가 될 수 있음을 시사합니다.
NAT1은 2상 외래물질 합성을 촉매하는 대사 효소로, 거의 모든 인체 조직에서 발현됩니다. NAT1은 방향족 아민 기질이 없는 경우에도 엽산을 보조인자로 사용하여 아세틸-CoA(acetyl-CoA)를 생성할 수 있습니다(Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). 연구에 따르면 NAT1은 유방암 세포 모델에서 기질 금속단백분해효소 9(MMP9)의 기능을 조절하고 포도당 결핍 시 활성산소종(ROS)으로부터 세포를 보호하는 것으로 나타났습니다(Wang et al., 2018). NAT1 유전자 결손은 피루브산 탈수소효소 복합체를 억제하여 미토콘드리아 기능 장애를 유발하는 것으로 밝혀졌습니다(Wang L. et al., 2019). 또한, 여러 연구에서 소분자 및 siRNA를 이용한 NAT1 억제가 유방암 세포의 침윤성과 증식을 감소시킬 수 있음을 보여주었습니다(Stepp et al., 2018). 최근 CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 유방암 세포주 MDA-MB-231에서 NAT1 발현을 억제한 연구에서는 NAT1 발현 수준에 따라 세포 대사에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 또한 이 연구는 NAT-1이 삼중 음성 유방암(TNBC)의 진행 및 전이에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다(Carlisle et al., 2020).
종양유전자의 조화로운 전사는 슈퍼 인핸서, 전사 인자 및 보조 인자에 의해 조절됩니다(Hnisz et al., 2015). 또한, CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, CDK13과 같은 사이클린 의존성 키나아제(CDK) 그룹은 전사 조절에 필수적입니다. 이 중 CDK7은 RNA 중합효소 II의 인산화에 관여하며, 이는 삼중 음성 유방암(TNBC) 발병 기전에서 종양유전자 전사의 개시 및 확장에 매우 중요합니다. 선구적인 연구에서 CRISPR/Cas9를 이용한 CDK7 유전자 삭제가 TNBC를 억제하는 것으로 나타났으며, 이는 TNBC 발병 기전이 CDK7에 의존적임을 시사합니다(Wang Y. et al., 2015).
연구에 따르면 MYC와 RBP(RNA 결합 단백질)의 돌연변이는 세포사멸을 유도할 수 있지만, MYC 또는 RBP의 단일 유전자 돌연변이는 암세포 성장에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다(Einstein et al., 2021). CRISPR/Cas9 기반 라이브러리를 사용하여 인간 게놈에서 1000개 이상의 RBP를 스크리닝한 결과, MYC 발현 수준이 매우 높은 암세포의 성장에 중요한 57개의 RBP가 확인되었습니다(Wheeler et al., 2020). 또한, YTHDF2는 삼중음성 유방암(TNBC) 세포 성장을 유지하는 데 중요하며, MYC 발현 수준이 높은 암세포에서 고수준 전사 및 번역 과정 중 메틸화된 전사체의 양을 감소시킵니다. 그러나 MYC 발현 수준이 높아도 TNBC 환자의 생존 기간이 연장되지 않는 암세포에서는 YTHDF2가 필수적이지 않다는 점(Einstein et al., 2021)을 고려할 때, YTHDF2는 TNBC를 극복할 수 있는 약물 개발의 잠재적인 치료 표적이 될 수 있습니다.
아연 손가락 단백질(ZNF)은 인간 게놈 전체의 약 1%를 차지합니다. 여러 연구에서 ZNF가 간암, 유방암, 대장암 등 다양한 암에서 세포 증식을 조절할 수 있음이 밝혀졌습니다(Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). CRISPR 유전자 편집 기술을 이용한 유전자 제거 라이브러리는 유방암 세포에서 다양한 종양 억제 유전자(TSG)를 선별하는 데 사용되어 왔습니다(Shalem et al., 2014). 이후 CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 ZNF319 유전자를 제거한 유방암 세포의 전사체 분석을 통해 ZNF319가 유방암 세포 증식을 억제하는 종양 억제 유전자이며, 다양한 신호 전달 기전 및 기타 생물학적 기능에 관여한다는 사실이 확인되었습니다(Wang L. et al., 2022).
철분 의존성 세포사멸(Ferroptosis)은 철분 존재에 의해 유발되는 일종의 프로그램된 세포사멸입니다. 철분 의존성 세포사멸의 발생은 지질 과산화물의 존재에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있습니다. 또한, PKCβII는 초기 지질 과산화를 유발하는 것으로 보고되었으며, 지질 과산화의 증가는 철분 의존성 세포사멸과 관련이 있습니다. CRISPR/Cas9 매개 키나제 억제제 라이브러리 스크리닝을 통해 PKCβII가 MDA-MB-231 세포에서 철분 의존성 세포사멸에 중요한 지질 과산화 과정에 관여한다는 사실이 밝혀졌습니다(Zhang et al., 2022). 따라서, CRISPR/Cas9를 이용한 PKCβII 유전자 제거는 철분 의존성 세포사멸 관련 질환 치료를 위한 잠재적인 종양 억제 유전자 표적이 될 수 있습니다(Zhang et al., 2022).
약물 내성은 암 환자 사망의 약 90%를 차지하는 주요 원인으로 여겨지며, 암 치료의 주요 난제 중 하나입니다(Bukowski et al., 2020). 연구 결과에 따르면 약물 배출, DNA 복구, 세포 사멸 및 다양한 세포 신호 전달 경로와 관련된 상당수의 유전자가 약물 내성과 연관되어 있습니다(Haider et al., 2020). 이러한 유전자들 중 일부는 CRISPR/Cas9 도구를 이용하여 표적화되었으며, 약물 내성을 감소시키고 항암 치료 효과를 높이는 데 유망한 결과를 보여주었습니다(Vaghari-Tabari et al., 2022). 또한, 고처리량 CRISPR/Cas9 유전자 녹아웃 스크리닝 라이브러리는 잠재적인 약물 내성 유전자 표적의 기능을 변형하는 데 활용될 수 있습니다(Shalem et al., 2015). 파클리탁셀 내성 유전자를 식별하기 위해 RNA 시퀀싱과 게놈 전체 sgRNA 라이브러리 스크리닝을 결합하여 재발성 삼중음성 유방암(TNBC) 환자의 약물 내성과 관련된 히스톤 탈아세틸화효소 9(HDAC9)를 포함한 8개의 후보 유전자를 확인했습니다(B et al., 2020). 또 다른 연구에서는 항암제로 치료받은 TNBC 환자의 생존 기간 동안 디세린/트레오닌 및 티로신 단백질 키나제(DSTYK)의 발현이 증가하는 것이 관찰되었습니다. 더욱이, CRISPR/Cas9 매개 DSTYK 녹다운은 시험관 내(SUM102PT 세포 및 MDA-MB-468 세포) 및 생체 내 TNBC 모델에서 약물 내성 암세포의 세포 사멸을 유의하게 증가시켰습니다(Ogbu et al., 2021).
삼중음성 유방암(TNBC)은 MAPK 경로의 비정상적인 활성화를 보이지만, MEK 표적 치료제의 임상 효과는 미미하다. CRISPR/Cas9 유전체 라이브러리 스크리닝을 통해 PSMG2(프로테옴 조립 샤페론 2) 억제가 TNBC 세포주인 BT549 및 MB468 세포의 MEK 억제제인 ​​AZD6244에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 나타났다. CRISPR/Cas9를 이용한 PSMG2 녹다운은 정상적인 프로테아좀 기능을 변화시켜 자가포식 매개 PDPK1 분해를 유도하고, 결과적으로 AZD6244(MEK 억제제) 및 MG132(프로테아좀 억제제)에 의해 유도된 TNBC 마우스 모델에서 종양 세포의 증식을 더욱 촉진시켰다. 따라서 프로테아좀 억제제와 MAP 키나제(MEK) 억제제를 병용 투여하면 종양 세포 증식을 억제하는 데 시너지 효과를 낼 수 있다(Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9는 TNBC 내성을 유발하는 유전자 기능 상실을 선별하는 데에도 사용되었습니다(Shu et al., 2020). Ge et al.은 BET 브로모도메인 억제제(BBDI)인 JQ1로 치료한 TNBC 암세포의 약물 내성 기전을 설명했습니다. CRISPR/Cas9를 사용하여 rb1 유전자를 삭제하면 TNBC가 항암제 JQ1에 내성을 갖게 된다는 것을 발견했습니다. 따라서 rb1 기능은 TNBC에서 JQ1 약물에 대한 반응에 중요한 역할을 합니다. 또한 Ge et al.은 파클리탁셀이 CDK4/6 키나제/미세소관 억제제이며, JQ1과 같은 BBDI와의 병용 요법이 약물 내성 TNBC에 유망한 치료 효과를 제공할 수 있다고 보고했습니다(Ge et al., 2020).
장쇄 비코딩 RNA(lncRNA)의 전사 양상은 삼중 음성 유방암(TNBC)의 신보조 요법에 대한 내성과 관련이 있는 것으로 보고되었습니다. 본 연구에서는 5가지 종류의 MALAT1 lncRNA 전사체가 TNBC에서 높은 발현량을 보인다는 것을 밝혀냈습니다. 또한, CRISPR/Cas9를 이용한 MALAT1 유전자 삭제는 TNBC BT-549 세포의 파클리탁셀 및 독소루비신에 대한 민감도를 증가시켜, TNBC에서 MALAT1이 내성에 관여할 가능성을 시사합니다(Shaath et al., 2021).
BRCA1 유전자 변이(BRCA1m)는 이질적이어서 검출하기 어렵습니다. BRCA1의 합성 치사 파트너인 PARP1(폴리(ADP-리보스) 중합효소)을 표적으로 삼으면 삼중 음성 유방암(TNBC)의 항암제 감수성을 높일 수 있습니다. CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 PARP1을 제거한 결과, 독소루비신, 젬시타빈, 도세탁셀과 같은 항암제에 대한 mBRCA1 변이 TNBC 세포의 감수성이 증가했으며, 이는 PARP1이 TNBC의 약물 내성에도 관여함을 시사합니다(Vaghari-Tabari et al., 2022). 종양 억제 유전자 BRCA1 또는 BRCA2의 변이는 유방암 발병 가능성을 높이는 것으로 알려져 있으며, 이러한 환자의 치료에는 PARP 억제제가 필요합니다. 또한, CRISPR/Cas9를 이용하여 뉴클레오티드 회수 인자 DNPH1을 제거하면 독성 뉴클레오티드인 5-하이드록시메틸데옥시우리딘(hmdU) 모노포스페이트를 제거할 수 있으며, 이를 통해 BRCA 결핍 세포의 PARP 억제제에 대한 민감도를 향상시킬 수 있음이 입증되었습니다(Fugger 등, 2021). 따라서 CRISPR/Cas9와 PARP1 억제제는 삼중 음성 유방암(TNBC)의 중요한 치료 전략이 될 수 있습니다.
침투성 당단백질(P-gp) 유전자는 삼중 약물 내성 유전자로, 일반적으로 모든 삼중 음성 유방암(TNBC)의 약 41%에서 상향 조절됩니다(Sun et al., 2020). P-gp에 의한 약물 유출은 유방암 약물 내성의 핵심 조절자로 알려져 있습니다. P-gp 억제제는 유방암에서 항암제 감수성을 증가시키는 것으로 나타났습니다(Famta et al., 2021). 따라서 CRISPR/Cas9 매개 P-gp 제거 또는 억제와 P-gp 억제제는 TNBC의 약물 내성을 극복하는 데 매우 중요한 방법이 될 수 있습니다.
ATP 결합 카세트 수송체 G2(ABCG2)는 삼중 음성 유방암(TNBC)에서 약물 내성을 유발하는 것으로 알려져 있지만(Palasuberniam et al., 2015), CRISPR/Cas9를 이용한 ABCG2 침묵화와 종양 억제 유전자 불활성화 사이의 관계에 대한 연구는 아직 보고된 바 없다. PTEN은 ABCG2 활성화를 촉진할 수 있다(Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). 따라서 CRISPR/Cas9를 이용하여 ABCG2를 제거하고 ABCG2 억제제와 병용하는 것이 TNBC의 약물 내성을 극복하는 데 적합한 치료법이 될 수 있다. 표 2는 모든 내성 유전자를 표적으로 하는 CRISPR/Cas9를 나타낸다.
표 2. CRISPR/Cas9는 다양한 TNBC 내성 유전자를 표적으로 삼아 세포의 항암제 민감도를 높입니다.
CRISPR/Cas9 라이브러리는 암 발병 기전과 관련된 유전자 돌연변이를 선별하는 데 유용한 도구입니다(Chan et al., 2022). 이 선별 방법은 (a) 라이브러리 구축, (b) 렌티바이러스 형질전환, (c) 표현형 선별, (d) 표적 유전자 분석의 네 단계로 구성됩니다. 삼중 음성 유방암(TNBC)은 MAPK 경로의 비정상적인 활성화를 보이지만, PTEN, RB1, TP53과 같은 종양 억제 유전자에 돌연변이가 있는 TNBC 환자에서 MEK 표적 치료의 임상 예후는 매우 좋지 않습니다.
또한, CRISPR/Cas9를 이용한 유전자 녹아웃 스크리닝을 통해 과테말라 꽃과 잎 추출물에 풍부하게 함유된 가장 강력하고 선택적인 분자인 데하이드로카트롤을 MDA-MB-231 세포에 미치는 영향과 선택적 세포 독성의 기전을 규명하고자 했습니다. TNBC 아형의 중간엽 줄기세포 특성 또한 연구의 중요한 부분이었습니다. 이 CRISPR/Cas9 기반 스크리닝 결과, 17β-하이드록시스테로이드 탈수소효소 11형을 코딩하는 유전자 HSD17B11이 MDA-MB-231 세포에서 높은 발현량을 보이며, MDA-MB-231 세포에 특이적인 데하이드로팔카리놀을 생성하는 것으로 나타났습니다(Grant et al., 2020). 따라서, CRISPR/Cas9 유전체 스크리닝은 잠재적인 천연 화합물의 항암 특성 기전을 규명하는 데 큰 잠재력을 가지고 있음을 시사합니다.
또한, 편향되지 않은 게놈 전체 생체 내 CRISPR/Cas9 스크리닝을 사용하여 TNBC의 암 발생 취약성을 연구한 결과, 종양 발생 경로와 종양 억제 경로 간의 연관성이 밝혀졌습니다. mTOR 및 Hippo 경로의 주요 구성 요소는 TNBC에서 종양 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었습니다. 또한, 연구에 따르면 mTORC1/2 및 YAP 종양 단백질의 약리학적 억제가 시험관 내 약물-기질 시너지 모델과 생체 내 환자 유래 이종이식 모델을 사용하여 TNBC의 병원성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났습니다. 더욱이, Torin-1 매개 mTORC1/2 억제는 대식세포작용을 증가시키는 반면, 베르테포르핀 유도 YAP 억제는 TNBC 세포 사멸을 유도합니다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 게놈 전체 생체 내 CRISPR 스크리닝은 TNBC에 대한 새롭고 효과적인 치료법을 발굴하는 데 있어 강력하고 견고한 방법임을 알 수 있습니다(Dai et al., 2021).
면역 체계의 기능 이상은 종양 발생의 중요한 요인입니다. 암세포는 종양 미세환경 내 면역 세포의 활동을 방해하고 면역 체계를 약화시키는 등 방어 기전을 우회하여 면역 제거를 회피합니다. 따라서 향상된 면역 체계를 개발하는 것이 종양과의 싸움에서 핵심적인 접근 방식이 될 수 있습니다. CRISPR/Cas9 기반 유전자 변형 기술은 다양한 관점에서 면역 기능 장애와 관련된 여러 문제를 해결합니다. CRISPR/Cas9는 다음과 같은 경로를 통해 유방암에 대한 항종양 면역을 향상시키는 데 사용되었습니다(그림 3).
그림 3. CRISPR/Cas9 면역요법은 TNBC 세포를 표적으로 한다. CDK5의 소실과 PDL1 및 CD155의 발현 억제는 면역 체계를 강화한다. 마찬가지로, A2AR의 소실과 HER2, 뮤신 1, TEM8과 같은 종양 관련 항원(TAA)의 발현 억제는 CAR-T 세포의 암세포 사멸 효율을 증가시킨다. CRISPR/Cas9 기반 T 세포 스크리닝 결과, p38 키나아제의 기능 상실이 T 세포의 항종양 활성을 향상시키는 것으로 나타났다. CRISPR/Cas9에 의해 변형된 T 세포는 TCR(T 세포 수용체)의 발현을 증가시켜 항종양 활성을 나타낸다.
면역요법의 목표는 면역 체계를 자극하여 암세포를 공격하도록 하는 것입니다. 면역 체크포인트 단백질의 과발현은 일반적으로 자가면역 반응을 억제하지만, 암세포가 이러한 반응을 회피하도록 도울 수 있습니다(Topalian et al., 2015). 이 단백질들은 면역 세포 표면의 수용체에 결합하여 면역 반응을 억제합니다. CD155 및 PD-L1과 같은 여러 체크포인트 단백질은 면역 세포의 PD-1 수용체를 표적으로 하며, 유방암, 특히 삼중 음성 유방암(TNBC)에서 발현됩니다(Li Y.-C. et al., 2020). CRISPR/Cas9를 이용하여 PD-L1 또는 그 수용체를 억제하면 면역 체계가 TNBC 종양을 공격하도록 자극할 수 있습니다(Yahata et al., 2019). 또한, CRISPR/Cas9 매개 CDK5 유전자 삭제를 통해 PD-L1 발현을 억제하면 시험관 내 및 생체 내에서 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났습니다(Deng et al., 2020). 유방암의 시험관 내 및 생체 내 모델에서 성장 억제는 shRNA를 이용한 CD155 감소가 유방암에 치료 효과가 있을 수 있음을 시사합니다(Gao et al., 2018).
CAR T 세포는 종양 관련 항원(TAA)을 인식하는 CAR을 발현하며, 체크포인트 단백질의 발현 억제를 통해 활성을 향상시킬 수 있습니다(Li C. et al., 2020). 유방암에서 CAR T 세포 치료의 잠재적 표적은 HER2, mucin1, TEM8 등 여러 TAA를 포함하여 다양합니다(Bajgain et al., 2018). TNBC BT-459 세포에서 과발현되는 메조텔린을 표적으로 하는 CAR T 세포는 CRISPR/Cas9를 이용하여 PD-1을 억제했을 때 암에 대한 효과가 더 높다는 연구 결과가 있습니다(Hu et al., 2019). 그러나 환자로부터 T 세포를 분리하고 체외에서 유전자 편집을 하는 과정은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요됩니다. 범용 T 세포는 분리 요건을 완화할 수 있지만, 이식편대숙주 이상을 예방하기 위해 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 및 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 공여자 T 세포를 제거해야 합니다(Ren et al., 2017a). CRISPR/Cas9를 이용한 HDR(고도 감수성 유전자 편집)은 TCR과 HLA를 동시에 제거하고 CAR(키메라 항원 수용체)를 코딩하는 유전자를 녹아웃시킬 수 있습니다. 연구에 따르면 CRISPR/Cas9를 사용하여 항-CD19 CAR를 TCR 유전자 자리에 도입함으로써 T 세포를 고갈시키지 않고 효율적으로 CAR를 생산할 수 있습니다(Dimitri et al., 2022). 다중화 기술을 통해 TCR, 베타-2-마이크로글로불린(B2M), HLA-I 서브유닛 및 PD-1, CTLA-4와 같은 다른 단백질을 동시에 제거하여 항암 효과가 더 뛰어난 동종 CAR T 세포를 생성할 수 있습니다. TNBC에 반대합니다(Eyquem 등, 2017; Liu 등, 2017; Ren 등, 2017b; Dimitri 등, 2022).
CRISPR/Cas9 기술을 활용하면 CAR-T 세포의 효능을 향상시킬 수 있습니다. 아데노신은 면역억제 특성을 가지고 있으며, T 세포 기능을 차단하고 아데노신 A2A 수용체(A2AR)를 활성화시켜 항암 면역 반응을 감소시키는 것으로 알려져 있습니다(Vigano et al., 2019). CRISPR/Cas9를 이용하여 A2AR을 억제하면 생체 내에서 CAR-T 세포의 효능이 크게 향상됩니다(Giuffrida et al., 2021). T 세포는 세포 증식, 분화, 산화 스트레스 및 유전체 스트레스와 같은 다양한 표현형 특성을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. CRISPR/Cas9 기반 T 세포 스크리닝을 통해 25가지의 서로 다른 T 세포 수용체 키나아제의 발현 억제가 확인되었습니다. 그중 p38 키나아제의 발현 억제는 T 세포의 항종양 활성을 향상시키는 것으로 나타났으며, 이는 p38 키나아제가 CAR-T 세포 조절의 핵심 조절자임을 시사합니다(Gurusamy et al., 2020).
CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 T 세포를 유전적으로 변형시켜 고도로 발현되는 TCR을 생성할 수 있습니다. 유전적으로 변형된 T 세포를 환자에게 이식하면 내인성 T 세포보다 더 강력한 항암 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 환자에서 내인성 TCR은 유전적으로 변형된 TCR과 경쟁할 수 있으며, 이는 암 면역 치료의 잠재력에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 수용자 세포에서 내인성 TCR-β를 제거하고, 그 결과로 생성된 TCR-β T 세포를 암 환자에게 이식하면 내인성 TCR과의 경쟁 없이 더 나은 항암 면역 반응을 유도할 수 있습니다(Fan et al., 2018). 따라서 CRISPR로 변형된 T 세포를 제외하면, TCR은 정상 TCR을 도입한 T 세포보다 종양 항원에 대해 천 배 더 민감합니다. 또한, 다양한 백혈병에서 γδ TCR+ CRISPR로 생성된 변형 T 세포는 표준 TCR 이식보다 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 발현이 더 높은 것으로 나타났습니다(Legut et al., 2018). 따라서 CRISPR/Cas9로 생성된 변형 T 세포는 삼중 음성 유방암(TNBC)을 극복하는 효과적인 면역 치료법이 될 수 있다.
인테그린은 세포막에 존재하는 세포 접착 분자로, 세포와 세포외기질(ECM)의 결합을 촉진합니다(Hamidi and Ivaska, 2018). 인테그린의 조절 이상은 세포외기질을 변화시켜 암세포의 혈액 내 생존을 유도함으로써 암 발생 및 전이와 관련이 있습니다(Hamidi and Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9를 이용한 인테그린 발현 억제는 삼중음성 유방암(TNBC)에서 종양 진행, 전이 및 집락 형성을 억제합니다. 인테그린 α5(ITGA5)의 발현 억제는 폐암과 같은 다른 암에서도 세포 이동 및 진행을 감소시키는 것으로 보고되었으며(Ju et al., 2017), 이는 인테그린 α5가 TNBC 발병기전의 핵심 인자일 수 있음을 시사합니다.
전통적인 배아줄기세포(ES 세포) 방법을 이용한 녹아웃 마우스 제작은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되며 비효율적인 과정입니다. 상동 재조합을 통해 ES 세포를 표적화하고, 키메라 마우스를 생산한 다음, 이들을 이형접합체 마우스와 교배하여 동형접합체 자손을 생산하는 데 수개월에서 수년이 걸립니다. 여러 유전자 변이를 가진 마우스를 만들기 위해서는 복잡한 교배 과정이 필요합니다. 그러나 CRISPR/Cas9를 이용한 ES 세포 제거 또는 단일 세포 수정란에 CRISPR/Cas9 구성 요소를 미세 주입하여 생성된 마우스를 사용할 때 여러 문제가 발생했습니다. 예를 들어, 변이 도입이 종종 양쪽 대립 유전자 위치에서 발생하고 유전자 특이적이지 않습니다. 최근 CRISPR/Cas9 기술을 이용한 ES 세포에서 최대 5개의 유전자에 양쪽 대립 유전자 변이를 동시에 도입할 수 있다는 연구 결과가 보고되었습니다(Nishizono et al., 2021). 이를 위해 Cas9 mRNA와 5개의 유전자 특이적 gRNA를 ES 세포에 동시에 형질전환했습니다. 이는 이 시술의 가능성과 효과를 강조하지만, 이러한 돌연변이는 5중 유전자 결손 마우스를 생산하기 위해 창시 계통을 교배하는 과정에서 전달되었을 가능성이 있습니다. 또한 이 연구는 놀라운 발견을 보고합니다. 유전자 변형 마우스를 만드는 데 더 이상 ES 세포가 필요하지 않다는 것입니다. 특정 유전자 산물을 제거하기 위해 Cas9 mRNA와 gRNA를 단일 세포 단계 배아에 주입했습니다. 그 결과, 이론적으로 마우스에서 유전자 결손의 결과를 연구하는 데 사용할 수 있는 유전자 결손 창시 계통이 만들어졌습니다(Qin et al., 2016). 따라서 CRISPR/Cas9는 기존의 유전자 공학보다 저렴한 비용으로 TNBC 치료용 형질전환 마우스를 만들 수 있게 해줍니다. CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 TNBC에서 하나 이상의 내인성 유전자에 점 돌연변이를 성공적으로 도입할 수 있는 새로운 유전자 결손 마우스 모델이 개발되었습니다. 이러한 개념을 바탕으로, BRCA1과 p53의 CRISPR/Cas9 매개 삭제를 이용하여 TNBC 동물 모델을 개발할 수도 있으며, 이는 HR 복구 기능 상실, 유전체 불안정성 및 돌연변이 표현형을 초래합니다(Annunziato et al., 2020).
현재 유방조영술, 자기공명영상(MRI), 초음파 등 다양한 방법이 삼중음성 유방암(TNBC) 진단에 사용되고 있습니다. 그러나 이러한 방법에는 몇 가지 한계가 있습니다. 유방조영술은 암세포가 다른 장기로 전이된 부위가 아닌 국소 유방 조직을 진단하는 데 사용됩니다. 초음파는 TNBC 진단에 신뢰할 수 있는 방법이 아닙니다(Chen and Lee-Felker, 2023). MRI는 초음파와 유방조영술보다 민감도가 높지만 진단 정확도에는 한계가 있습니다(Sha and Chen, 2022). 조직 생검은 암세포를 확인하는 침습적인 방법입니다. 하지만 바늘이 관심 부위에서 벗어나는 경우 암 조직을 놓칠 수 있습니다. 또한 비용이 매우 높고 환자에게 심리적 고통을 줄 수 있습니다. TNBC는 이질적인 유형의 암이기 때문에 생검만으로는 암의 종류에 대한 충분한 정보를 얻을 수 없습니다. 따라서 TNBC를 진단할 수 있는 새롭고 신뢰할 수 있는 방법이 시급히 필요합니다. CRISPR/Cas9는 유방암 진단에 있어 높은 민감도와 최소 침습성을 갖춘 대안이 될 수 있습니다. 특히, CRISPR/Cas9 기반 전략은 삼중 음성 유방암(TNBC) 진단을 위한 PCR 방법을 개선하는 데 활용될 수 있습니다. 먼저, CRISPR 시스템의 Cas9 및 cpf1 단백질을 이용하여 비특이적 DNA를 제거한 후, 이 두 단백질(Cas9 및 cpf1)이 표적 DNA에 결합하기 전에 PAM 서열을 인식하도록 합니다(Deepak Singh et al., 2021). 따라서, PCR을 통해 암 발생과 관련된 돌연변이를 식별할 수 있습니다. 여러 연구에서 다양한 암에서 다양한 돌연변이를 검출하기 위해 이 CRISPR 기반 전략을 적용했습니다(Safari et al., 2019). 이처럼 CRISPR 기반 PCR 방법은 생검 기반 면역조직화학 검사와 같은 침습적인 방법에 대한 TNBC 진단의 의존도를 줄일 수 있을 것입니다.
삼중음성 유방암(TNBC)에서도 호르몬 수용체 조절의 유전형 변화가 확인되었습니다(Chen and Russo, 2009). 마이크로어레이를 이용한 CRISPR/Cas9 기반 PCR 전략은 현장 진단에서 이러한 돌연변이를 효과적으로 모니터링할 수 있습니다(Hajian et al., 2019). 또한 의료진에게 TNBC 환자의 특정 돌연변이에 대한 관련 정보를 제공하여 치료 과정 개선에 도움을 줄 수 있습니다. 그러나 이 복합 기술에는 한계가 있습니다. 따라서 이 CRISPR/Cas-PCR 방법을 TNBC 진단에 의료 현장에 적용하기 위해서는 광범위한 연구가 필요합니다(Yang et al., 2019).