컴퓨터 단층촬영(CT)으로 확인된 폐결절의 감별 진단은 임상 실습에서 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.여기에서는 건강한 대조군, 양성 폐 결절 및 1기 폐 선암종을 포함한 480개 혈청 샘플의 전체 대사체를 특성화합니다.선암종은 독특한 대사 프로필을 보이는 반면, 양성 결절과 건강한 개체는 대사 프로필에서 높은 유사성을 보입니다.발견 그룹(n = 306)에서는 양성 결절과 악성 결절을 구별하기 위해 27개의 대사산물 세트가 확인되었습니다.내부 검증(n = 104) 및 외부 검증(n = 111) 그룹에서 판별 모델의 AUC는 각각 0.915 및 0.945였습니다.경로 분석에서는 양성 결절 및 건강한 대조군과 비교하여 폐 선암종 혈청에서 트립토판 감소와 관련된 해당 대사 산물이 증가한 것으로 나타났으며, 트립토판 흡수가 폐암 세포에서 해당 분해를 촉진한다는 것을 시사했습니다.우리의 연구는 CT로 발견된 폐결절의 위험을 평가할 때 혈청 대사산물 바이오마커의 가치를 강조합니다.
암 환자의 생존율을 높이려면 조기 진단이 중요합니다.미국 국립 폐암 검진 시험(NLST)과 유럽 NELSON 연구 결과에 따르면 저선량 컴퓨터 단층촬영(LDCT)을 통한 검진은 고위험군에서 폐암 사망률을 크게 줄일 수 있는 것으로 나타났습니다1,2,3.폐암 검진을 위해 LDCT가 널리 사용된 이후, 무증상 폐결절의 우연한 방사선 소견 발생률이 계속 증가했습니다4.폐 결절은 직경 5 최대 3cm의 초점 혼탁으로 정의됩니다.우리는 악성 종양의 가능성을 평가하고 LDCT에서 우연히 발견된 다수의 폐결절을 처리하는 데 어려움을 겪고 있습니다.CT의 한계로 인해 후속 검사가 자주 실시되고 위양성 결과가 나와 불필요한 개입과 과잉 치료가 발생할 수 있습니다6.따라서 초기 단계에서 폐암을 정확하게 식별하고 초기 발견 시 대부분의 양성 결절을 구별할 수 있는 신뢰할 수 있고 유용한 바이오마커를 개발할 필요가 있습니다7.
유전체학, 단백질체학 또는 DNA 메틸화8,9,10를 포함한 혈액(혈청, 혈장, 말초 혈액 단핵 세포)의 포괄적인 분자 분석을 통해 폐암 진단 바이오마커 발견에 대한 관심이 높아지고 있습니다.한편, 대사체학 접근법은 내인성 및 외인성 작용의 영향을 받는 세포 최종 산물을 측정하므로 질병 발병 및 결과를 예측하는 데 적용됩니다.액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS)은 높은 감도와 큰 동적 범위로 인해 대사체학 연구에 널리 사용되는 방법으로, 다양한 물리화학적 특성을 가진 대사산물을 포괄할 수 있습니다.폐암 진단14,15,16,17 및 치료 효능과 관련된 바이오마커를 식별하기 위해 혈장/혈청에 대한 전반적인 대사체 분석이 사용되었지만, 양성 폐결절과 악성 폐결절을 구별하기 위한 혈청 대사산물 분류자는 아직 많은 연구가 진행되고 있습니다.-대규모 연구.
선암종과 편평 세포 암종은 비소세포폐암(NSCLC)의 두 가지 주요 아형입니다.다양한 CT 선별검사 결과에 따르면 선암종이 폐암의 가장 흔한 조직학적 유형인 것으로 나타났습니다1,19,20,21.이 연구에서 우리는 초고성능 액체 크로마토그래피-고분해능 질량 분석법(UPLC-HRMS)을 사용하여 건강한 대조군, 양성 폐결절 및 CT에서 검출된 3 cm 이하를 포함하여 총 695개의 혈청 샘플에 대한 대사체학 분석을 수행했습니다.1기 폐 선암종에 대한 선별검사.우리는 폐 선암종을 양성 결절 및 건강한 대조군과 구별하는 혈청 대사 산물 패널을 확인했습니다.경로 농축 분석에 따르면 비정상적인 트립토판 및 포도당 대사는 양성 결절 및 건강한 대조군과 비교하여 폐 선암종에서 일반적인 변화인 것으로 나타났습니다.마지막으로, 우리는 조기 감별 진단 및 위험 평가에 도움이 될 수 있는 LDCT로 검출된 악성 폐결절과 양성 폐결절을 구별하기 위해 높은 특이성과 민감도를 갖춘 혈청 대사 분류기를 확립하고 검증했습니다.
현재 연구에서는 성별 및 연령이 일치하는 혈청 샘플을 건강한 대조군 174명, 양성 폐 결절 환자 292명, I기 폐 선암 환자 229명으로부터 후향적으로 수집했습니다.695명의 피험자의 인구통계학적 특성은 보충 표 1에 나와 있습니다.
그림 1a에 표시된 대로 174개의 건강한 대조군(HC), 170개의 양성 결절(BN) 및 136개의 I기 폐 선암종(LA) 샘플을 포함하여 총 480개의 혈청 샘플이 Sun Yat-sen University Cancer Center에서 수집되었습니다.초고성능 액체 크로마토그래피-고분해능 질량분석법(UPLC-HRMS)을 사용하여 비표적 대사체 프로파일링을 위한 발견 코호트입니다.보충 그림 1에서 볼 수 있듯이 LA와 HC, LA와 BN 사이의 차등 대사 산물을 식별하여 분류 모델을 확립하고 차등 경로 분석을 추가로 탐색했습니다.쑨원대학교 암센터에서 수집한 104개 검체와 다른 2개 병원에서 수집한 111개 검체를 각각 내부 검증과 외부 검증을 거쳤습니다.
초고성능 액체 크로마토그래피-고해상도 질량 분석법(UPLC-HRMS)을 사용하여 글로벌 혈청 대사체학 분석을 실시한 발견 코호트의 연구 모집단.b 건강한 대조군(HC, n = 174), 양성 결절(BN, n = 170) 및 1기 폐 선암종을 포함하여 연구 코호트에서 얻은 480개 혈청 샘플의 전체 대사체에 대한 부분 최소 제곱 판별 분석(PLS-DA) (로스앤젤레스, n = 136).+ESI, 양성 전기분무 이온화 모드, -ESI, 음성 전기분무 이온화 모드.c –e 주어진 두 그룹(양측 Wilcoxon 부호 순위 테스트, 잘못된 발견률 조정 p 값, FDR <0.05)에서 상당히 다른 존재비를 갖는 대사 산물은 빨간색(배 변화 > 1.2) 및 파란색(배 변화 < 0.83)으로 표시됩니다. .) 화산 그래픽에 표시됩니다.f LA와 BN 사이의 주석이 달린 대사산물 수의 중요한 차이를 보여주는 계층적 클러스터링 히트 맵.소스 데이터는 소스 데이터 파일 형태로 제공됩니다.
발견 그룹의 174 HC, 170 BN 및 136 LA의 총 혈청 대사체를 UPLC-HRMS 분석을 사용하여 분석했습니다.먼저 품질 관리(QC) 샘플이 감독되지 않은 주성분 분석(PCA) 모델의 중심에 밀접하게 클러스터되어 현재 연구 성능의 안정성을 확인한다는 것을 보여줍니다(보충 그림 2).
그림 1b의 부분 최소 제곱 판별 분석(PLS-DA)에서 볼 수 있듯이 양성(+ESI) 및 음성(-ESI) 전기분무 이온화 모드에서 LA와 BN, LA와 HC 사이에 명확한 차이가 있음을 발견했습니다. .외딴.그러나 +ESI 및 -ESI 조건에서는 BN과 HC 간에 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다.
우리는 LA와 HC 사이에 382개의 차등 특징, LA와 BN 사이에 231개의 차등 특징, BN과 HC 사이에 95개의 차등 특징을 발견했습니다(Wilcoxon 부호 순위 테스트, FDR <0.05 및 다중 변경 >1.2 또는 <0.83)(그림 .1c-e) )..m/z 값, 유지 시간 및 단편화 질량 스펙트럼 검색(자세한 내용은 방법 섹션에 설명되어 있음) 22에 따라 데이터베이스(mzCloud/HMDB/Chemspider 라이브러리)에 대해 피크에 추가로 주석을 달았습니다(보충 데이터 3).마지막으로, LA 대 BN(그림 1f 및 보충 표 2) 및 LA 대 HC(보충 그림 3 및 보충 표 2)에 대해 각각 유의미한 차이가 있는 33 및 38개의 주석이 달린 대사 산물이 확인되었습니다.대조적으로, PLS-DA에서 BN과 HC 사이의 중복과 일치하는 BN과 HC(보충 표 2)에서는 존재비에 유의미한 차이가 있는 3개의 대사 산물만이 확인되었습니다.이러한 차등 대사산물은 광범위한 생화학물질을 포괄합니다(보충 그림 4).종합하면, 이러한 결과는 양성 폐 결절 또는 건강한 대상과 비교하여 초기 단계 폐암의 악성 변형을 반영하는 혈청 대사체의 중요한 변화를 보여줍니다.한편, BN과 HC의 혈청 대사체 유사성은 양성 폐결절이 건강한 개인과 많은 생물학적 특성을 공유할 수 있음을 시사합니다.표피 성장 인자 수용체(EGFR) 유전자 돌연변이가 폐 선암종 하위 유형 23에서 흔히 발생한다는 점을 고려하여 우리는 운전자 돌연변이가 혈청 대사체에 미치는 영향을 확인하려고 했습니다.그런 다음 폐 선암종 그룹에서 EGFR 상태가 있는 72개 사례의 전반적인 대사 프로필을 분석했습니다.흥미롭게도 우리는 PCA 분석에서 EGFR 돌연변이 환자 (n = 41)와 EGFR 야생형 환자 (n = 31) 사이에 비슷한 프로필을 발견했습니다 (보충 그림 5a).그러나 우리는 야생형 EGFR 환자 (t 테스트, p <0.05 및 배수 변화> 1.2 또는 <0.83)와 비교하여 EGFR 돌연변이 환자에서 풍부도가 크게 변경된 7 가지 대사 산물을 확인했습니다 (보충 그림 5b).이러한 대사산물의 대부분(7개 중 5개)은 지방산 산화 경로에서 중요한 역할을 하는 아실카르니틴입니다.
그림 2a에 표시된 작업 흐름에 설명된 대로 결절 분류를 위한 바이오마커는 최소 절대 수축 연산자와 LA(n = 136) 및 BN(n = 170)에서 식별된 33개의 차등 대사 산물을 기반으로 한 선택을 사용하여 얻었습니다.최적의 변수 조합(LASSO) – 이진 로지스틱 회귀 모델.모델의 신뢰성을 테스트하기 위해 10겹 교차 검증이 사용되었습니다.변수 선택 및 매개변수 정규화는 매개변수 λ24를 사용하여 우도 최대화 페널티에 의해 조정됩니다.판별 모델의 분류 성능을 테스트하기 위해 내부 검증(n = 104) 및 외부 검증(n = 111) 그룹에서 전역 대사체학 분석을 독립적으로 추가로 수행했습니다.그 결과, 발견 세트의 27개 대사산물은 평균 AUC 값이 가장 큰 최고의 판별 모델로 확인되었으며(그림 2b), 그 중 9개는 BN에 비해 LA에서 활성이 증가했고 18개는 활성이 감소했습니다(그림 2c).
10겹 교차 검증을 통해 이진 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 발견 세트에서 최고의 혈청 대사산물 패널을 선택하고 내부 및 외부 검증 세트에서 예측 성능을 평가하는 것을 포함하여 폐결절 분류기를 구축하기 위한 워크플로입니다.b 대사 바이오마커 선택을 위한 LASSO 회귀 모델의 교차 검증 통계.위에 주어진 숫자는 주어진 λ에서 선택된 바이오마커의 평균 수를 나타냅니다.빨간색 점선은 해당 람다의 평균 AUC 값을 나타냅니다.회색 오류 막대는 최소 및 최대 AUC 값을 나타냅니다.점선은 선택된 27개의 바이오마커가 있는 최상의 모델을 나타냅니다.AUC는 ROC(수신기 작동 특성) 곡선 아래 영역입니다.c 발견 그룹의 BN 그룹과 비교하여 LA 그룹에서 선택된 27개의 대사 산물의 변화를 접습니다.빨간색 열 – 활성화.파란색 기둥은 하락세입니다.d – f 발견, 내부 및 외부 검증 세트의 27개 대사 산물 조합을 기반으로 한 판별 모델의 성능을 보여주는 ROC(수신기 작동 특성) 곡선.소스 데이터는 소스 데이터 파일 형태로 제공됩니다.
예측 모델은 이들 27개 대사산물의 가중 회귀 계수를 기반으로 만들어졌습니다(보충 표 3).이들 27개 대사산물을 기반으로 한 ROC 분석 결과 AUC(곡선 아래 면적) 값은 0.933, 발견 그룹 민감도는 0.868, 특이도는 0.859였습니다(그림 2d).한편, LA와 HC 사이의 주석이 달린 38개의 차등 대사산물 중 16개의 대사산물 세트는 HC와 LA를 구별하는 데 있어 민감도 0.801, 특이도 0.856으로 AUC 0.902를 달성했습니다(보충 그림 6a-c).차등 대사산물에 대한 다양한 배수 변화 역치를 기반으로 한 AUC 값도 비교되었습니다.우리는 접기 변경 수준이 1.2 대 1.5 또는 2.0으로 설정되었을 때 분류 모델이 LA와 BN(HC)을 구별하는 데 가장 잘 수행된다는 것을 발견했습니다(보충 그림 7a, b).27개의 대사산물 그룹을 기반으로 한 분류 모델은 내부 및 외부 코호트에서 추가로 검증되었습니다.AUC는 내부 검증의 경우 0.915(민감도 0.867, 특이도 0.811), 외부 검증의 경우 0.945(민감도 0.810, 특이도 0.979)였습니다(그림 2e, f).실험실 간 효율성을 평가하기 위해 방법 섹션에 설명된 대로 외부 코호트의 샘플 40개를 외부 실험실에서 분석했습니다.분류 정확도는 0.925의 AUC를 달성했습니다(보충 그림 8).폐 편평 세포 암종(LUSC)은 폐 선암종(LUAD) 다음으로 비소세포 폐암(NSCLC)의 두 번째로 흔한 하위 유형이기 때문에 우리는 또한 대사 프로필의 검증된 잠재적 유용성을 테스트했습니다.BN 외 LUSC 16예.LUSC와 BN 간의 차별 AUC는 0.776(보충 그림 9)으로, LUAD와 BN 간의 차별에 비해 능력이 떨어지는 것을 나타냅니다.
연구에 따르면 CT 영상의 결절 크기는 악성 가능성과 양의 상관관계가 있으며 결절 치료의 주요 결정 요인으로 남아 있습니다25,26,27.NELSON 선별 연구의 대규모 코호트 데이터 분석에 따르면 5 mm 미만의 결절이 있는 대상의 악성 종양 위험은 결절이 없는 대상의 악성 종양 위험과 심지어 유사했습니다28.따라서 정기적인 CT 모니터링이 필요한 최소 크기는 영국 흉부 학회(BTS)에서 권장하는 5mm, Fleischner Society 29에서 권장하는 6mm입니다.그러나 6mm보다 크고 명백한 양성 특징이 없는 불확정 폐결절(IPN)이라고 불리는 결절은 임상 실습에서 평가 및 관리에 있어 주요 과제로 남아 있습니다30,31.다음으로 발견 및 내부 검증 코호트의 풀링된 샘플을 사용하여 결절 크기가 대사체 서명에 영향을 미치는지 여부를 조사했습니다.27개의 검증된 바이오마커에 초점을 맞춰 우리는 먼저 HC 및 BN sub-6 mm 대사체의 PCA 프로파일을 비교했습니다.우리는 HC와 BN에 대한 대부분의 데이터 포인트가 겹쳐져 혈청 대사 산물 수준이 두 그룹 모두에서 유사하다는 것을 확인했습니다 (그림 3a).다양한 크기 범위의 특징 맵은 BN과 LA에서 보존 된 반면 (그림 3b, c), 6-20 mm 범위의 악성 결절과 양성 결절 사이의 분리가 관찰되었습니다 (그림 3d).이 코호트는 6~20mm 크기의 결절의 악성 종양을 예측하는 데 있어 AUC가 0.927, 특이도가 0.868, 민감도가 0.820이었습니다(그림 3e, f).우리의 결과는 분류기가 결절 크기에 관계없이 초기 악성 변형으로 인한 대사 변화를 포착할 수 있음을 보여줍니다.
광고 27개 대사물질의 대사 분류자를 기반으로 특정 그룹 간의 PCA 프로필 비교.CC 및 BN < 6mm.b BN < 6mm 대 BN 6–20mm.LA 6–20mm 대 LA 20–30mm.g BN 6~20mm 및 LA 6~20mm.GC, n = 174;BN < 6mm, n = 153;BN 6~20mm, n = 91;LA 6~20mm, n = 89;LA 20-30mm, n = 77. e 결절 6-20mm에 대한 판별 모델 성능을 보여주는 ROC(수신기 작동 특성) 곡선.f 6~20mm 크기의 결절에 대한 로지스틱 회귀 모델을 기반으로 확률 값을 계산했습니다.회색 점선은 최적의 컷오프 값(0.455)을 나타냅니다.위의 숫자는 로스앤젤레스에서 예상되는 사례의 비율을 나타냅니다.양측 스튜던트 t 테스트를 사용합니다.PCA, 주성분 분석.곡선 아래의 AUC 영역.소스 데이터는 소스 데이터 파일 형태로 제공됩니다.
제안된 악성종양 예측 모델의 성능을 설명하기 위해 유사한 폐결절 크기(7-9 mm)를 가진 4개의 샘플(44-61세)을 추가로 선택했습니다(그림 4a, b).초기 선별검사에서 Case 1은 양성과 관련된 특징인 석회화가 있는 고형 결절로 나타났고, Case 2는 뚜렷한 양성 특징이 없는 불확실한 부분 고형 결절로 나타났습니다.3회에 걸친 추적 CT 스캔 결과, 이러한 사례는 4년 동안 안정적으로 유지되어 양성 결절로 간주되었습니다(그림 4a).연속 CT 스캔의 임상 평가와 비교하여, 현재 분류 모델을 사용한 단회 혈청 대사산물 분석은 확률적 제약 조건을 기반으로 이러한 양성 결절을 빠르고 정확하게 식별했습니다(표 1).사례 3의 그림 4b는 흉막 수축 징후가 있는 결절을 보여 주며, 이는 악성 종양과 가장 흔히 관련됩니다.사례 4는 양성 원인의 증거가 없는 불확실한 부분 고형 결절로 나타났습니다.이러한 모든 사례는 분류기 모델에 따라 악성으로 예측되었습니다(표 1).폐 선암종의 평가는 폐 절제 수술 후 조직병리학적 검사를 통해 입증되었습니다(그림 4b).외부 검증 세트의 경우 대사 분류기는 6mm보다 큰 불확실한 폐 결절의 두 가지 사례를 정확하게 예측했습니다(보충 그림 10).
양성 결절 2예의 폐 축 창 CT 영상.Case 1의 경우 4년 후 CT 검사에서 우하엽에 석회화를 동반한 7mm 크기의 안정적인 고형 결절이 관찰되었습니다.사례 2의 경우 5년 후 CT 스캔에서 오른쪽 상엽에 직경 7mm의 안정적이고 부분적으로 단단한 결절이 나타났습니다.b 폐 절제술 전 1 기 선암종의 두 사례에 대한 폐의 축 방향 창 CT 이미지 및 해당 병리학 적 연구.증례 3에서는 흉막 수축을 동반한 우측 상엽에 직경 8mm의 결절이 발견되었습니다.사례 4에서는 왼쪽 상엽에 9mm 크기의 부분적으로 단단한 간유리 결절이 나타났습니다.폐 선암종의 선포 성장 패턴을 보여주는 절제된 폐 조직의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색(눈금 막대 = 50μm).화살표는 CT 영상에서 발견된 결절을 나타냅니다.H&E 이미지는 병리학자가 검사한 다중(>3) 현미경 필드의 대표적인 이미지입니다.
종합하면, 우리의 결과는 폐 결절의 감별 진단에서 혈청 대사산물 바이오마커의 잠재적 가치를 보여 주며, 이는 CT 검사를 평가할 때 문제가 될 수 있습니다.
검증된 차등 대사 산물 패널을 기반으로 우리는 주요 대사 변화의 생물학적 상관 관계를 식별하려고 했습니다.MetaboAnalyst에 의한 KEGG 경로 농축 분석은 주어진 두 그룹 사이에서 6개의 공통적으로 크게 변경된 경로를 식별했습니다(LA 대 HC 및 LA 대 BN, 조정된 p ≤ 0.001, 효과 > 0.01).이러한 변화는 피루브산 대사, 트립토판 대사, 니아신 및 니코틴아미드 대사, 해당작용, TCA 회로 및 퓨린 대사의 장애로 특징지어집니다(그림 5a).그런 다음 절대 정량화를 사용하여 주요 변화를 확인하기 위해 표적 대사체학을 추가로 수행했습니다.실제 대사물질 표준을 사용하여 삼중 사중극자 질량분석법(QQQ)을 통해 일반적으로 변경된 경로에서 공통 대사물질을 측정합니다.대사체학 연구 대상 샘플의 인구통계학적 특성은 보충 표 4에 포함되어 있습니다. 우리의 글로벌 대사체학 결과와 일치하여 정량 분석을 통해 BN 및 HC에 비해 LA에서 하이포잔틴과 크산틴, 피루브산염 및 젖산염이 증가한 것으로 확인되었습니다(그림 5b, c, p <0.05).그러나 BN과 HC 간에는 이러한 대사 산물의 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다.
BN 및 HC 그룹과 비교하여 LA 그룹에서 상당히 다른 대사 산물에 대한 KEGG 경로 농축 분석.양측 글로벌 테스트(two-tailed Globaltest)를 사용하였고, p값은 Holm-Bonferroni 방법을 사용하여 조정하였다(p ≤ 0.001, 효과 크기 > 0.01로 조정).b – d LC-MS / MS (그룹당 n = 70)에 의해 결정된 혈청 HC, BN 및 LA의 하이포 잔틴, 잔틴, 젖산염, 피루브산염 및 트립토판 수준을 보여주는 바이올린 플롯.흰색과 검은색 점선은 각각 중앙값과 사분위수를 나타냅니다.e LUAD-TCGA 데이터 세트의 정상 폐 조직(n = 59)과 비교하여 폐 선암종(n = 513)에서 SLC7A5 및 QPRT의 정규화된 Log2TPM(백만 개당 전사체) mRNA 발현을 보여주는 바이올린 플롯.흰색 상자는 사분위수 범위를 나타내고 중앙의 검은색 가로선은 중앙값을 나타내며 상자에서 연장된 검은색 세로선은 95% 신뢰구간(CI)을 나타냅니다.f TCGA 데이터 세트의 폐 선암종(n = 513) 및 정상 폐 조직(n = 59)에서 SLC7A5 및 GAPDH 발현의 피어슨 상관 관계 도표.회색 영역은 95% CI를 나타냅니다.r, 피어슨 상관 계수.g LC-MS/MS에 의해 결정된 비특이적 shRNA 대조군(NC) 및 shSLC7A5(Sh1, Sh2)로 형질감염된 A549 세포의 표준화된 세포 트립토판 수준.각 그룹에서 생물학적으로 독립적인 5개 샘플에 대한 통계 분석이 제공됩니다.h A549 세포(NC) 및 SLC7A5 녹다운 A549 세포(Sh1, Sh2)에서 NADt(NAD+ 및 NADH를 포함한 총 NAD)의 세포 수준.각 그룹에서 생물학적으로 독립적인 3개의 샘플에 대한 통계 분석이 제시됩니다.i SLC7A5 녹다운 전후의 A549 세포의 당분해 활성을 세포외 산성화율(ECAR)로 측정했습니다(그룹당 생물학적으로 독립적인 샘플 4개).2-DG,2-데옥시-D-글루코스.(b-h)에서는 양측 스튜던트 t 테스트가 사용되었습니다.(g-i)에서 오차 막대는 평균 ± SD를 나타내며 각 실험은 독립적으로 3회 수행되었으며 결과는 유사했습니다.소스 데이터는 소스 데이터 파일 형태로 제공됩니다.
LA 그룹에서 변경된 트립토판 대사의 중요한 영향을 고려하여 QQQ를 사용하여 HC, BN 및 LA 그룹의 혈청 트립토판 수준도 평가했습니다.우리는 HC 또는 BN과 비교하여 LA에서 혈청 트립토판이 감소한 것을 발견했습니다(p < 0.001, 그림 5d). 이는 순환 트립토판 수준이 대조군의 건강한 대조군보다 폐암 환자에서 더 낮다는 이전 연구 결과와 일치합니다33,34 ,35.PET/CT 추적자 11C-메틸-L-트립토판을 사용한 또 다른 연구에서는 폐암 조직의 트립토판 신호 유지 시간이 양성 병변이나 정상 조직에 비해 크게 증가한 것으로 나타났습니다.우리는 LA 혈청의 트립토판 감소가 폐암 세포의 활성 트립토판 흡수를 반영할 수 있다고 가정합니다.
트립토판 이화작용의 키누레닌 경로의 최종 생성물은 NAD+37,38이며, 이는 해당과정에서 글리세르알데히드-3-인산염과 1,3-비스포스포글리세레이트의 반응에 중요한 기질인 것으로 알려져 있습니다39.이전 연구는 면역 조절에서 트립토판 이화 작용의 역할에 초점을 맞추었지만, 우리는 현재 연구에서 관찰된 트립토판 조절 장애와 해당 경로 사이의 상호 작용을 밝히려고 노력했습니다.용질 수송체 패밀리 7 멤버 5(SLC7A5)는 트립토판 수송체인 것으로 알려져 있습니다.퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라제(QPRT)는 퀴놀린산을 NAMN46으로 전환하는 키누레닌 경로 하류에 위치한 효소입니다.LUAD TCGA 데이터 세트를 조사한 결과 SLC7A5와 QPRT가 모두 정상 조직에 비해 종양 조직에서 유의하게 상향조절된 것으로 나타났습니다(그림 5e).이 증가는 폐 선암종의 단계 I 및 II뿐만 아니라 단계 III 및 IV에서 관찰되었으며(보충 그림 11), 이는 종양 형성과 관련된 트립토판 대사의 초기 장애를 나타냅니다.
또한 LUAD-TCGA 데이터 세트는 암 환자 샘플에서 SLC7A5와 GAPDH mRNA 발현 사이에 양의 상관 관계를 보여주었습니다(r = 0.45, p = 1.55E-26, 그림 5f).대조적으로, 정상 폐 조직에서 이러한 유전자 시그니처 사이에는 유의한 상관관계가 발견되지 않았습니다(r = 0.25, p = 0.06, 그림 5f).A549 세포에서 SLC7A5(보충 그림 12)의 녹다운은 세포 트립토판 및 NAD(H) 수준을 크게 감소시켰으며(그림 5g, h), 세포외 산성화 속도(ECAR)로 측정한 해당작용 활성이 약화되었습니다(그림 1).5i).따라서 혈청 및 시험관 내 검출의 대사 변화를 기반으로 우리는 트립토판 대사가 키누레닌 경로를 통해 NAD+를 생성하고 폐암에서 해당작용을 촉진하는 데 중요한 역할을 할 수 있다는 가설을 세웠습니다.
연구 결과에 따르면 LDCT로 발견된 불확정 폐결절이 다수일 경우 악성 종양에 대한 위양성 진단으로 인해 PET-CT, 폐생검, 과잉 치료 등의 추가 검사가 필요할 수 있는 것으로 나타났습니다.31 그림 6에서 볼 수 있듯이, 우리 연구에서는 CT로 발견된 폐결절의 위험 계층화 및 후속 관리를 개선할 수 있는 잠재적인 진단 가치가 있는 혈청 대사산물 패널을 확인했습니다.
폐 결절은 양성 또는 악성 원인을 암시하는 영상 특징을 갖춘 저선량 컴퓨터 단층촬영(LDCT)을 사용하여 평가됩니다.결절의 불확실한 결과는 빈번한 후속 방문, 불필요한 개입 및 과잉 치료로 이어질 수 있습니다.진단 가치가 있는 혈청 대사 분류자를 포함하면 폐결절의 위험 평가 및 후속 관리가 향상될 수 있습니다.PET 양전자 방출 단층 촬영.
미국 NLST 연구와 유럽 NELSON 연구의 데이터에 따르면 저선량 컴퓨터 단층촬영(LDCT)으로 고위험군을 선별하면 폐암 사망률을 줄일 수 있는 것으로 나타났습니다1,3.그러나 LDCT로 발견된 다수의 우발적 폐결절에 대한 위험 평가 및 후속 임상 관리는 여전히 가장 어려운 과제로 남아 있습니다.주요 목표는 신뢰할 수 있는 바이오마커를 통합하여 기존 LDCT 기반 프로토콜의 올바른 분류를 최적화하는 것입니다.
혈액 대사산물과 같은 특정 분자 바이오마커는 폐암을 건강한 대조군과 비교하여 확인되었습니다15,17.현재 연구에서는 LDCT에서 우연히 발견된 양성 폐결절과 악성 폐결절을 구별하기 위해 혈청 대사체학 분석을 적용하는 데 중점을 두었습니다.우리는 UPLC-HRMS 분석을 사용하여 건강한 대조군(HC), 양성 폐 결절(BN) 및 1기 폐 선암종(LA) 샘플의 전체 혈청 대사체를 비교했습니다.우리는 HC와 BN이 비슷한 대사 프로파일을 갖는 반면 LA는 HC와 BN에 비해 중요한 변화를 보였다는 것을 발견했습니다.우리는 LA를 HC 및 BN과 구별하는 두 세트의 혈청 대사 산물을 확인했습니다.
양성 및 악성 결절에 대한 현재 LDCT 기반 식별 체계는 주로 시간 경과에 따른 결절의 크기, 밀도, 형태 및 성장률을 기반으로 합니다30.이전 연구에서는 결절의 크기가 폐암 발생 가능성과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났습니다.고위험 환자의 경우에도 6mm 미만의 림프절에서 악성 종양이 발생할 위험은 1% 미만입니다.6~20mm 크기의 결절에 대한 악성 종양 위험은 8%~64%30입니다.따라서 Fleischner Society에서는 일상적인 CT 추적 관찰을 위해 컷오프 직경 6mm를 권장합니다.29 그러나 크기가 6 mm를 초과하는 불확정 폐결절(IPN)에 대한 위험 평가 및 관리는 적절하게 수행되지 않았습니다31.선천성 심장병의 현재 관리는 일반적으로 빈번한 CT 모니터링과 주의 깊은 대기를 기반으로 합니다.
검증된 대사체를 기반으로 우리는 건강한 개인과 6mm 미만의 양성 결절 사이의 대사체 시그니처가 겹치는 것을 처음으로 입증했습니다.생물학적 유사성은 결절 <6mm의 악성 종양 위험이 결절이 없는 피험자의 경우만큼 낮다는 이전 CT 연구 결과와 일치합니다. 대사 프로파일의 유사성은 양성 병인의 기능적 정의가 결절 크기에 관계없이 일관됨을 시사합니다.따라서 현대 진단 혈청 대사산물 패널은 CT에서 결절이 처음 발견될 때 배제 테스트로 단일 분석을 제공하고 잠재적으로 연속 모니터링을 줄일 수 있습니다.동시에, 동일한 대사 바이오마커 패널은 양성 결절과 크기가 6mm 이상인 악성 결절을 구별하고 CT 영상에서 유사한 크기 및 모호한 형태학적 특징의 IPN에 대한 정확한 예측을 제공했습니다.이 혈청 대사 분류기는 AUC 0.927로 ≥6mm 결절의 악성 종양을 예측하는 데 효과적이었습니다.종합하면, 우리의 결과는 고유한 혈청 대사체 특징이 초기 종양 유발 대사 변화를 구체적으로 반영할 수 있으며 결절 크기와 관계없이 위험 예측변수로서 잠재적인 가치를 가질 수 있음을 나타냅니다.
특히 폐선암종(LUAD)과 편평세포암종(LUSC)은 비소세포폐암(NSCLC)의 주요 유형입니다.LUSC가 담배 사용과 밀접한 관련이 있고47 LUAD가 CT 검사에서 발견된 부수적 폐 결절의 가장 일반적인 조직학이라는 점을 고려하면48 분류 모델은 I기 선암종 샘플을 위해 특별히 구축되었습니다.Wang과 동료들은 또한 LUAD에 중점을 두고 초기 단계 폐암과 건강한 개인을 구별하기 위해 지질학을 사용하여 9개의 지질 특징을 식별했습니다17.우리는 1기 LUSC의 16개 사례와 양성 결절 74개에 대해 현재 분류기 모델을 테스트한 결과 낮은 LUSC 예측 정확도(AUC 0.776)를 관찰했는데, 이는 LUAD와 LUSC가 고유한 대사체 특징을 가질 수 있음을 시사합니다.실제로 LUAD와 LUSC는 병인, 생물학적 기원 및 유전적 이상에서 서로 다른 것으로 나타났습니다.따라서 선별 프로그램에서 인구 기반 폐암 검출을 위한 훈련 모델에는 다른 유형의 조직학이 포함되어야 합니다.
여기에서 우리는 건강한 대조군 및 양성 결절과 비교하여 폐 선암종에서 가장 자주 변경되는 6가지 경로를 확인했습니다.잔틴과 하이포잔틴은 퓨린 대사 경로의 일반적인 대사산물입니다.우리의 결과와 일치하게, 퓨린 대사와 관련된 중간체는 건강한 대조군이나 침습성 단계의 환자와 비교하여 폐 선암종 환자의 혈청이나 조직에서 유의하게 증가했습니다15,50.증가된 혈청 잔틴 및 하이포잔틴 수치는 빠르게 증식하는 암세포에 필요한 동화작용을 반영할 수 있습니다.포도당 대사 조절 장애는 암 대사의 잘 알려진 특징입니다51.여기에서 우리는 HC 및 BN 그룹에 비해 LA 그룹에서 피루브산과 젖산의 유의한 증가를 관찰했는데, 이는 비소세포폐암(NSCLC) 환자의 혈청 대사체 프로파일에서 해당 경로 이상에 대한 이전 보고와 일치합니다. 건강한 통제.결과는 일관적입니다52,53.
중요하게도 우리는 폐 선암종의 혈청에서 피루브산과 트립토판 대사 사이의 역상관관계를 관찰했습니다.혈청 트립토판 수치는 HC 또는 BN 그룹에 비해 LA 그룹에서 감소했습니다.흥미롭게도 전향적 코호트를 사용한 이전의 대규모 연구에서는 낮은 수준의 순환 트립토판이 폐암 위험 증가와 관련이 있음을 발견했습니다54.트립토판은 우리가 음식에서 전적으로 섭취하는 필수 아미노산입니다.우리는 폐 선암종에서 혈청 트립토판 고갈이 이 대사산물의 급속한 고갈을 반영할 수 있다고 결론을 내렸습니다.키누레닌 경로를 통한 트립토판 이화작용의 최종 산물이 새로운 NAD+ 합성의 원천이라는 것은 잘 알려져 있습니다.NAD+는 주로 회수 경로를 통해 생산되기 때문에 건강과 질병에서 트립토판 대사에서 NAD+의 중요성은 아직 결정되지 않았습니다46.TCGA 데이터베이스에 대한 우리의 분석에 따르면 트립토판 수송체 용질 수송체 7A5(SLC7A5)의 발현은 정상 대조군에 비해 폐 선암종에서 유의하게 증가했으며 해당효소 GAPDH의 발현과 양의 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다.이전 연구에서는 주로 항종양 면역 반응을 억제하는 트립토판 이화작용의 역할에 초점을 맞춰왔습니다.여기에서 우리는 폐암 세포에서 SLC7A5의 녹다운에 의한 트립토판 흡수의 억제가 세포의 NAD 수준의 후속 감소와 그에 따른 해당작용 활성의 약화를 초래한다는 것을 입증합니다.요약하면, 본 연구는 폐 선암종의 악성 형질전환과 관련된 혈청 대사 변화에 대한 생물학적 기초를 제공합니다.
EGFR 돌연변이는 NSCLC 환자에서 가장 흔한 동인 돌연변이입니다.우리 연구에서 우리는 EGFR 돌연변이 환자(n = 41)가 야생형 EGFR 환자(n = 31)와 유사한 전반적인 대사 프로파일을 가지고 있음을 발견했지만, 아실카르니틴 환자에서 일부 EGFR 돌연변이 환자의 혈청 수치가 감소한 것을 발견했습니다.아실카르니틴의 확립된 기능은 아실기를 세포질에서 미토콘드리아 기질로 운반하여 지방산을 산화시켜 에너지를 생성하는 것입니다 55.우리 연구 결과와 일치하는 최근 연구에서는 102개의 폐 선암종 조직 샘플의 전체 대사체를 분석하여 EGFR 돌연변이와 EGFR 야생형 종양 사이의 유사한 대사체 프로파일을 확인했습니다50.흥미롭게도 아실카르니틴 함량은 EGFR 돌연변이 그룹에서도 발견되었습니다.따라서 아실카르니틴 수준의 변화가 EGFR에 의해 유발된 대사 변화와 근본적인 분자 경로를 반영하는지 여부는 추가 연구가 필요할 수 있습니다.
결론적으로, 본 연구에서는 폐결절의 감별진단을 위한 혈청 대사 분류기를 확립하고 CT 스캔 스크리닝을 기반으로 위험 평가를 최적화하고 임상 관리를 용이하게 할 수 있는 워크플로우를 제안합니다.
이 연구는 쑨원대학교 암병원 윤리위원회, 쑨원대학교 제1부속병원, 정저우대학교 암병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다.발견 및 내부 검증 그룹에서는 건강한 개인의 혈청 174개와 양성 결절의 혈청 244개를 쑨원대학교 암센터 암통제예방부에서 매년 건강 검진을 받는 개인과 양성 결절 166개에서 수집했습니다.혈청.1기 폐 선암종은 Sun Yat-sen University Cancer Center에서 수집되었습니다.외부 검증 코호트에는 양성 결절 48건, 중산대학교 제1병원의 1기 폐 선암 39건, 정저우 암병원의 1기 폐 선암 24건이 있었습니다.또한 쑨원대학교 암센터는 확립된 대사 분류기의 진단 능력을 테스트하기 위해 1기 편평 세포 폐암 16예를 수집했습니다(환자 특성은 보충 표 5에 표시됨).발견 코호트 및 내부 검증 코호트의 샘플은 2018년 1월부터 2020년 5월 사이에 수집되었습니다. 외부 검증 코호트의 샘플은 2021년 8월부터 2022년 10월 사이에 수집되었습니다. 성별 편견을 최소화하기 위해 대략 동일한 수의 남성 및 여성 사례가 각 사례에 할당되었습니다. 보병대.발견팀과 내부검토팀.참가자의 성별은 자기보고를 바탕으로 결정되었습니다.모든 참가자로부터 사전 동의를 얻었으며 보상은 제공되지 않았습니다.양성 결절이 있는 대상자는 수술 전 채취하여 조직병리학적 소견을 통해 외부검증 검체를 채취한 1예를 제외하고는 분석 당시 2~5년 사이에 안정적인 CT 검사 점수를 보인 대상자였다.만성 기관지염을 제외하고.폐 선암종 사례는 폐 절제술 전에 수집되었으며 병리학 적 진단으로 확인되었습니다.공복 혈액 샘플은 항응고제 없이 혈청 분리 튜브에 수집되었습니다.혈액 샘플을 실온에서 1시간 동안 응고시킨 후 2851 x g에서 4°C에서 10분간 원심분리하여 혈청 상층액을 수집했습니다.혈청 분취량은 대사산물이 추출될 때까지 -80°C에서 동결되었습니다.쑨원대학교 암센터 암 예방 및 건강 검진부는 40~55세의 남성과 여성을 포함해 100명의 건강한 기증자로부터 혈청 풀을 수집했습니다.각 기증자 샘플의 동일한 부피를 혼합하고 생성된 풀을 분취하여 -80°C에서 보관했습니다.혈청 혼합물은 품질 관리 및 데이터 표준화를 위한 참고 자료로 사용되었습니다.
참조 혈청과 테스트 샘플을 해동하고 복합 추출 방법(MTBE/메탄올/물)을 사용하여 대사산물을 추출했습니다56.간단히 말하면, 혈청 50μl를 얼음처럼 차가운 메탄올 225μl 및 얼음처럼 차가운 메틸 tert-부틸 에테르(MTBE) 750μl와 혼합했습니다.혼합물을 저어주고 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.그런 다음 샘플을 혼합하고 내부 표준물질(13C-락테이트, 13C3-피루베이트, 13C-메티오닌 및 13C6-이소류신, Cambridge Isotope Laboratories에서 구입)을 함유한 188μl의 MS 등급 물과 와류 혼합했습니다.그런 다음 혼합물을 4°C에서 10분 동안 15,000 x g에서 원심분리하고, 양성 및 음성 모드의 LC-MS 분석을 위해 하부 상을 두 개의 튜브(각각 125 μL)로 옮겼습니다.마지막으로 샘플을 고속 진공 농축기에서 증발 건조시켰습니다.
건조된 대사산물을 120μl의 80% 아세토니트릴에 재구성하고 5분간 vortexing한 후 4°C에서 10분간 15,000 x g로 원심분리했습니다.대사체학 연구를 위해 상청액을 마이크로인서트가 있는 호박색 유리 바이알에 옮겼습니다.초고성능 액체 크로마토그래피-고분해능 질량분석법(UPLC-HRMS) 플랫폼을 통한 비표적 대사체학 분석.대사산물은 Dionex Ultimate 3000 UPLC 시스템과 ACQUITY BEH Amide 컬럼(2.1 × 100mm, 1.7μm, Waters)을 사용하여 분리되었습니다.양이온 모드에서 이동상은 95%(A) 및 50% 아세토니트릴(B)이었으며, 각각 10mmol/L 아세트산암모늄과 0.1% 포름산을 함유했습니다.네거티브 모드에서 이동상 A와 B는 각각 95%와 50% 아세토니트릴을 함유했으며, 두 상 모두 10mmol/L 암모늄 아세테이트, pH = 9를 함유했습니다. 기울기 프로그램은 다음과 같습니다: 0~0.5분, 2% B;0.5~12분, 2~50% B;12~14분, 50~98% B;14~16분, 98% B;16–16.1.최소, 98 –2% B;16.1~20분, 2% B. 자동 시료 주입기에서 컬럼을 40°C로, 시료를 10°C로 유지했습니다.유속은 0.3 ml/min, 주입량은 3 μl였습니다.전기분무 이온화(ESI) 소스를 갖춘 Q-Exactive Orbitrap 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)를 전체 스캔 모드에서 작동하고 ddMS2 모니터링 모드와 결합하여 대량의 데이터를 수집했습니다.MS 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다: 스프레이 전압 +3.8 kV/- 3.2 kV, 모세관 온도 320°C, 보호 가스 40 ab, 보조 가스 10 ab, 프로브 히터 온도 350°C, 스캔 범위 70-1050 m/h, 해결.70,000. Xcalibur 4.1(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 데이터를 수집했습니다.
데이터 품질을 평가하기 위해 각 샘플에서 상등액의 10μL 분취량을 제거하여 풀링된 품질 관리(QC) 샘플을 생성했습니다.UPLC-MS 시스템의 안정성을 평가하기 위해 분석 순서의 시작 부분에서 6개의 품질 관리 샘플 주입을 분석했습니다.품질 관리 샘플은 주기적으로 배치에 도입됩니다.본 연구에서 혈청 샘플의 11개 배치는 모두 LC-MS로 분석되었습니다.100명의 건강한 기증자로부터 얻은 혈청 풀 혼합물의 분취량을 각 배치의 참조 물질로 사용하여 추출 과정을 모니터링하고 배치 간 효과를 조정했습니다.발견 코호트, 내부 검증 코호트, 외부 검증 코호트에 대한 비표적 대사체학 분석은 중산대학교 대사체학 센터에서 수행되었습니다.광동기술대학교 분석 및 테스트 센터의 외부 실험실도 분류 모델의 성능을 테스트하기 위해 외부 코호트의 샘플 40개를 분석했습니다.
추출 및 재구성 후, 다중 반응 모니터링(MRM) 모드에서 전자분무 이온화(ESI) 소스를 사용하는 초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석기(Agilent 6495 삼중 사중극자)를 사용하여 혈청 대사산물의 절대 정량을 측정했습니다.ACQUITY BEH Amide 컬럼(2.1 × 100mm, 1.7μm, Waters)을 사용하여 대사산물을 분리했습니다.이동상은 90%(A) 및 5% 아세토니트릴(B)과 10mmol/L 암모늄 아세테이트 및 0.1% 암모니아 용액으로 구성되었습니다.그라데이션 프로그램은 다음과 같습니다: 0~1.5분, 0% B;1.5~6.5분, 0~15% B;6.5~8분, 15% B;8~8.5분, 15%~0% B;8.5~11.5분, 0%B.자동 시료 주입기에서 컬럼은 40°C로, 시료는 10°C로 유지되었습니다.유속은 0.3 mL/min이었고 주입량은 1 μL였습니다.MS 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다: 모세관 전압 ±3.5 kV, 분무기 압력 35 psi, 외장 가스 흐름 12 L/min, 외장 가스 온도 350°C, 건조 가스 온도 250°C 및 건조 가스 흐름 14 l/min.트립토판, 피루브산염, 젖산염, 하이포잔틴 및 크산틴의 MRM 전환율은 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 및 151.0–107이었습니다.각각 9개.데이터는 Mass Hunter B.07.00(Agilent Technologies)을 사용하여 수집되었습니다.혈청 시료의 경우, 표준 혼합액의 검량선을 이용하여 트립토판, 피루브산염, 젖산염, 하이포잔틴, 잔틴을 정량화하였다.세포 샘플의 경우 트립토판 함량을 내부 표준 및 세포 단백질 질량에 대해 정규화했습니다.
피크 추출(m/z 및 머무름 시간(RT))은 Liquid Discovery 3.1 및 TraceFinder 4.0(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행되었습니다.배치 간의 잠재적인 차이를 제거하기 위해 테스트 샘플의 각 특성 피크를 동일한 배치의 기준 물질의 특성 피크로 나누어 상대 존재비를 구했습니다.표준화 전과 후의 내부 표준의 상대 표준 편차는 보충 표 6에 나와 있습니다. 두 그룹 간의 차이는 잘못된 발견율(FDR<0.05, Wilcoxon 부호 순위 테스트)과 배수 변화(>1.2 또는 <0.83)로 특징 지어졌습니다.추출된 특징의 원시 MS 데이터와 참조 혈청 보정 MS 데이터는 각각 보충 데이터 1 및 보충 데이터 2에 표시됩니다.피크 주석은 식별된 대사산물, 추정적으로 주석이 달린 화합물, 추정적으로 특성화된 화합물 클래스 및 알려지지 않은 화합물을 포함하여 정의된 4가지 식별 수준을 기반으로 수행되었습니다 22 .Liquid Discovery 3.1(mzCloud, HMDB, Chemspider)의 데이터베이스 검색을 기반으로 MS/MS가 검증된 표준과 일치하거나 mzCloud(점수 > 85) 또는 Chemspider의 정확한 일치 주석이 있는 생물학적 화합물이 최종적으로 차등 대사체 사이의 중간체로 선택되었습니다.각 기능에 대한 피크 주석은 보충 데이터 3에 포함되어 있습니다. MetaboAnalyst 5.0은 합계 정규화 대사 산물 풍부도의 단 변량 분석에 사용되었습니다.MetaboAnalyst 5.0은 또한 상당히 다른 대사산물을 기반으로 KEGG 경로 농축 분석을 평가했습니다.주성분 분석(PCA) 및 부분 최소 제곱 판별 분석(PLS-DA)은 스택 정규화 및 자동 크기 조정 기능이 있는 ropls 소프트웨어 패키지(v.1.26.4)를 사용하여 분석되었습니다.결절 악성종양을 예측하기 위한 최적의 대사산물 바이오마커 모델은 최소 절대 수축 및 선택 연산자(LASSO, R 패키지 v.4.1-3)를 사용한 이진 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 생성되었습니다.탐지 및 검증 세트에서 판별 모델의 성능은 pROC 패키지(v.1.18.0.)에 따른 ROC 분석을 기반으로 AUC를 추정하여 특성화되었습니다.최적 확률 컷오프는 모델의 최대 Youden 지수(민감도 + 특이도 – 1)를 기준으로 구했습니다.임계값보다 작거나 큰 값을 갖는 샘플은 각각 양성 결절 및 폐 선암종으로 예측됩니다.
A549 세포(#CCL-185, American Type Culture Collection)를 10% FBS를 함유하는 F-12K 배지에서 성장시켰다.SLC7A5 및 비표적 대조군(NC)을 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 서열을 렌티바이러스 벡터 pLKO.1-puro에 삽입했습니다.shSLC7A5의 안티센스 서열은 다음과 같습니다: Sh1(5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2(5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').SLC7A5(#5347) 및 튜불린(#2148)에 대한 항체는 Cell Signaling Technology에서 구입했습니다.SLC7A5에 대한 항체와 튜불린을 웨스턴 블롯 분석을 위해 1:1000으로 희석하여 사용했습니다.
Seahorse XF 당분해 스트레스 테스트는 세포외 산성화(ECAR) 수준을 측정합니다.분석에서, 포도당, 올리고마이신 A 및 2-DG를 순차적으로 투여하여 ECAR로 측정된 세포 분해 능력을 테스트했습니다.
비표적화 대조군(NC) 및 shSLC7A5(Sh1, Sh2)로 형질감염된 A549 세포를 직경 10cm 접시에 밤새 플레이팅했습니다.세포 대사산물을 얼음처럼 차가운 80% 수성 메탄올 1ml로 추출했습니다.메탄올 용액의 세포를 긁어낸 후 새 튜브에 모아 15,000 x g에서 4°C에서 15분간 원심분리했습니다.고속 진공 농축기를 사용하여 상등액 800 μl를 수집하고 건조시킵니다.그런 다음 건조된 대사산물 펠릿을 위에서 설명한 대로 LC-MS/MS를 사용하여 트립토판 수준에 대해 분석했습니다.A549 세포(NC 및 shSLC7A5)의 세포 NAD(H) 수준은 제조업체의 지침에 따라 정량적 NAD+/NADH 비색 키트(#K337, BioVision)를 사용하여 측정되었습니다.대사산물의 양을 표준화하기 위해 각 샘플에 대해 단백질 수준을 측정했습니다.
표본 크기를 사전에 결정하기 위해 통계적 방법을 사용하지 않았습니다.바이오마커 발견15,18을 목표로 한 이전 대사체학 연구는 크기 결정을 위한 벤치마크로 간주되었으며 이러한 보고서와 비교하면 우리의 샘플이 적절했습니다.연구 코호트에서 샘플이 제외되지 않았습니다.비표적 대사체학 연구를 위해 혈청 샘플을 발견군(306건, 74.6%)과 내부 검증군(104건, 25.4%)에 무작위로 배정했습니다.또한 표적 대사체학 연구를 위한 발견 세트의 각 그룹에서 70개의 사례를 무작위로 선택했습니다.연구자들은 LC-MS 데이터 수집 및 분석 중에 그룹 할당을 알지 못했습니다.대사체학 데이터 및 세포 실험의 통계 분석은 해당 결과, 그림 범례 및 방법 섹션에 설명되어 있습니다.세포 트립토판, NADT 및 해당작용 활성의 정량화는 동일한 결과로 독립적으로 3회 수행되었습니다.
연구 설계에 대한 자세한 내용은 이 기사와 관련된 Natural Portfolio Report Abstract를 참조하세요.
추출된 특징의 원시 MS 데이터와 참조 혈청의 정규화된 MS 데이터는 각각 보충 데이터 1과 보충 데이터 2에 표시됩니다.차등 기능에 대한 피크 주석은 보충 데이터 3에 나와 있습니다. LUAD TCGA 데이터 세트는 https://portal.gdc.cancer.gov/에서 다운로드할 수 있습니다.그래프를 그리기 위한 입력 데이터는 소스 데이터에 제공됩니다.이 기사에 대한 소스 데이터가 제공됩니다.
국립폐암검진연구회 등 저선량 컴퓨터 단층촬영으로 폐암 사망률 감소.북부 잉글랜드.J. Med.365, 395–409(2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR 및 Prophet, PC 저선량 나선형 CT를 사용한 폐암 검진: 국립 폐 검진 연구(NLST) 결과.J. Med.화면 18, 109–111(2011).
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게시 시간: 2023년 9월 18일