컴퓨터 단층촬영(CT)으로 확인된 폐결절의 감별 진단은 임상에서 여전히 어려운 과제입니다. 본 연구에서는 건강한 대조군, 양성 폐결절, 그리고 1기 폐선암 환자를 포함한 480개의 혈청 샘플에 대한 전체 대사체를 분석했습니다. 폐선암은 독특한 대사체 프로파일을 나타내는 반면, 양성 결절과 건강한 대조군은 대사체 프로파일에서 높은 유사성을 보였습니다. 탐색 그룹(n=306)에서 양성 및 악성 결절을 구별하는 데 사용할 수 있는 27개의 대사체가 확인되었습니다. 판별 모델의 AUC는 내부 검증 그룹(n=104)과 외부 검증 그룹(n=111)에서 각각 0.915와 0.945였습니다. 경로 분석 결과, 폐선암 혈청에서는 양성 결절 및 건강한 대조군에 비해 트립토판 감소와 관련된 해당 과정 대사체가 증가했으며, 이는 트립토판 흡수가 폐암 세포에서 해당 과정을 촉진함을 시사합니다. 본 연구는 CT로 발견된 폐결절의 위험을 평가하는 데 있어 혈청 대사물질 바이오마커의 가치를 강조합니다.
조기 진단은 암 환자의 생존율 향상에 매우 중요합니다. 미국 국립 폐암 검진 연구(NLST)와 유럽 NELSON 연구 결과에 따르면 저선량 컴퓨터 단층촬영(LDCT)을 이용한 검진은 고위험군에서 폐암 사망률을 유의미하게 감소시킬 수 있는 것으로 나타났습니다.1,2,3 폐암 검진에 LDCT가 널리 사용됨에 따라 무증상 폐결절의 우연한 방사선학적 발견 빈도가 지속적으로 증가하고 있습니다.4 폐결절은 직경 3cm 이하의 국소 음영으로 정의됩니다.5 LDCT에서 우연히 발견되는 수많은 폐결절의 악성 가능성을 평가하고 적절하게 처리하는 데 어려움이 있습니다. CT의 한계로 인해 잦은 추적 검사와 위양성 결과가 발생하여 불필요한 시술과 과잉 치료로 이어질 수 있습니다.6 따라서 조기에 폐암을 정확하게 진단하고 초기 발견 시 대부분의 양성 결절을 감별할 수 있는 신뢰할 수 있고 유용한 바이오마커를 개발할 필요가 있습니다.7
혈액(혈청, 혈장, 말초혈액 단핵세포)에 대한 포괄적인 분자 분석(유전체학, 단백체학, DNA 메틸화 분석 포함)8,9,10은 폐암 진단 바이오마커 발굴에 대한 관심을 증대시켜 왔습니다. 한편, 대사체학 접근법은 내인성 및 외인성 작용의 영향을 받는 세포 최종 산물을 측정하여 질병 발병 및 예후 예측에 활용됩니다. 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS)은 높은 감도와 넓은 동적 범위로 인해 다양한 물리화학적 특성을 가진 대사체를 분석할 수 있어 대사체학 연구에 널리 사용되는 방법입니다11,12,13. 혈장/혈청의 전반적인 대사체 분석을 통해 폐암 진단14,15,16,17 및 치료 효과18와 관련된 바이오마커를 식별해 왔지만, 양성 및 악성 폐 결절을 구분하는 혈청 대사체 분류기에 대한 연구는 아직 미흡한 실정입니다.
선암과 편평세포암은 비소세포폐암(NSCLC)의 두 가지 주요 아형입니다. 다양한 CT 스크리닝 검사에서 선암이 가장 흔한 폐암 조직학적 유형으로 나타났습니다.1,19,20,21 본 연구에서는 초고성능 액체 크로마토그래피-고해상도 질량 분석법(UPLC-HRMS)을 이용하여 건강한 대조군, 양성 폐결절, 그리고 CT에서 3cm 이하로 발견된 1기 폐선암을 포함한 총 695개의 혈청 샘플에 대한 대사체 분석을 수행했습니다. 그 결과, 폐선암을 양성 결절 및 건강한 대조군과 구별하는 혈청 대사물질 패널을 확인했습니다. 경로 농축 분석 결과, 트립토판과 포도당 대사 이상이 양성 결절 및 건강한 대조군에 비해 폐선암에서 공통적으로 나타나는 변화임을 확인했습니다. 마지막으로, 우리는 저선량 CT(LDCT)로 검출된 악성 및 양성 폐결절을 구별하는 데 높은 특이도와 민감도를 갖는 혈청 대사 분류기를 개발하고 검증했으며, 이는 조기 감별 진단 및 위험 평가에 도움이 될 수 있습니다.
본 연구에서는 성별과 연령이 일치하는 건강한 대조군 174명, 양성 폐결절 환자 292명, 1기 폐선암 환자 229명의 혈청 샘플을 후향적으로 수집하였다. 총 695명의 대상자에 대한 인구통계학적 특성은 부록 표 1에 제시되어 있다.
그림 1a에서 보는 바와 같이, 쑨얏센대학교 암센터에서 건강 대조군(HC) 174개, 양성 결절(BN) 170개, 1기 폐선암(LA) 136개를 포함한 총 480개의 혈청 샘플을 수집했습니다. 이 샘플들은 초고성능 액체 크로마토그래피-고해상도 질량 분석법(UPLC-HRMS)을 이용한 비표적 대사체 프로파일링을 위한 탐색 코호트였습니다. 보충 그림 1에서 보는 바와 같이, LA와 HC, LA와 BN 간의 차별적 대사체를 식별하여 분류 모델을 구축하고 차별적 경로 분석을 추가로 수행했습니다. 쑨얏센대학교 암센터에서 수집한 104개 샘플과 다른 두 병원에서 수집한 111개 샘플을 각각 내부 및 외부 검증에 사용했습니다.
a 초고성능 액체 크로마토그래피-고해상도 질량 분석법(UPLC-HRMS)을 이용한 전반적인 혈청 대사체 분석을 받은 발견 코호트의 연구 대상 집단. b 건강 대조군(HC, n = 174), 양성 결절(BN, n = 170), 1기 폐선암(로스앤젤레스, n = 136)을 포함한 연구 코호트의 480개 혈청 샘플에 대한 전체 대사체에 대한 부분 최소 제곱 판별 분석(PLS-DA). +ESI: 양이온 전기분무 이온화 모드, -ESI: 음이온 전기분무 이온화 모드. c–e 두 그룹에서 유의미하게 다른 풍부도를 나타내는 대사체(양측 윌콕슨 부호 순위 검정, 거짓 발견율 조정 p값, FDR <0.05)는 빨간색(배율 변화 > 1.2)과 파란색(배율 변화 < 0.83)으로 표시되어 화산 그래프에 나타나 있다. f. 계층적 클러스터링 히트맵은 LA와 BN 간의 주석이 달린 대사물질 수에서 유의미한 차이를 보여줍니다. 원본 데이터는 소스 데이터 파일 형태로 제공됩니다.
탐색 그룹에 속한 174명의 건강한 대조군(HC), 170명의 양성 대조군(BN), 136명의 양성 대조군(LA)의 전체 혈청 대사체를 UPLC-HRMS 분석을 이용하여 분석하였다. 먼저, 품질 관리(QC) 샘플들이 비지도 주성분 분석(PCA) 모델의 중심에 밀집되어 군집을 형성하는 것을 보여줌으로써 본 연구의 안정성을 확인하였다(보충 그림 2).
그림 1b의 부분 최소 제곱 판별 분석(PLS-DA)에서 볼 수 있듯이, 양성(+ESI) 및 음성(−ESI) 전기분무 이온화 모드에서 LA와 BN, LA와 HC 사이에는 뚜렷한 차이가 있었습니다. 그러나 +ESI 및 -ESI 조건에서 BN과 HC 사이에는 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다.
LA와 HC 간에는 382개의 차별적 특징, LA와 BN 간에는 231개의 차별적 특징, 그리고 BN과 HC 간에는 95개의 차별적 특징이 발견되었습니다(윌콕슨 부호 순위 검정, FDR <0.05 및 다중 변화 >1.2 또는 <0.83)(그림 1c-e). 피크는 m/z 값, 유지 시간 및 단편화 질량 스펙트럼 검색을 통해 데이터베이스(mzCloud/HMDB/Chemspider 라이브러리)에 대해 추가적으로 주석 처리되었습니다(보충 자료 3)(자세한 내용은 방법 섹션 참조) 22. 최종적으로, LA와 BN 간에는 풍부도에서 유의미한 차이를 보이는 33개, LA와 HC 간에는 유의미한 차이를 보이는 38개의 주석 처리된 대사체가 확인되었습니다(그림 1f 및 보충표 2). 대조적으로, BN과 HC 간에는 풍부도에서 유의미한 차이를 보이는 대사체가 3개만 확인되었으며(보충표 2), 이는 PLS-DA에서 BN과 HC 간의 중복과 일치합니다. 이러한 차별적 대사산물은 광범위한 생화학 물질을 포함합니다(보충 그림 4). 종합적으로, 이러한 결과는 양성 폐결절이나 건강한 사람과 비교했을 때 초기 단계 폐암의 악성 변형을 반영하는 혈청 대사체에 상당한 변화가 있음을 보여줍니다. 한편, 양성 폐결절(BN)과 건강한 사람(HC)의 혈청 대사체 유사성은 양성 폐결절이 건강한 사람과 많은 생물학적 특성을 공유할 수 있음을 시사합니다. 상피세포 성장인자 수용체(EGFR) 유전자 변이가 폐선암 23형에서 흔하다는 점을 고려하여, 우리는 주요 변이가 혈청 대사체에 미치는 영향을 확인하고자 했습니다. 그런 다음 폐선암 그룹에서 EGFR 상태를 가진 72명의 환자에 대한 전체 대사체 프로파일을 분석했습니다. 흥미롭게도, 주성분 분석(PCA)에서 EGFR 변이 환자(n=41)와 EGFR 야생형 환자(n=31) 간에 유사한 프로파일을 발견했습니다(보충 그림 5a). 그러나 우리는 EGFR 돌연변이가 있는 환자에서 야생형 EGFR을 가진 환자에 비해 존재량이 유의하게 변화된 7가지 대사산물을 확인했습니다(t 검정, p < 0.05 및 fold change > 1.2 또는 < 0.83) (보충 그림 5b). 이들 대사산물의 대부분(7개 중 5개)은 지방산 산화 경로에서 중요한 역할을 하는 아실카르니틴입니다.
그림 2a에 나타낸 워크플로우에서 볼 수 있듯이, LA(n=136)와 BN(n=170)에서 확인된 33개의 차별적 대사체를 기반으로 최소 절대 수축 연산자(LASSO)와 선택을 사용하여 결절 분류를 위한 바이오마커를 얻었습니다. 최적 변수 조합(LASSO)은 이진 로지스틱 회귀 모델입니다. 모델의 신뢰성을 검증하기 위해 10겹 교차 검증을 사용했습니다. 변수 선택 및 매개변수 정규화는 매개변수 λ24를 갖는 우도 최대화 페널티로 조정되었습니다. 판별 모델의 분류 성능을 검증하기 위해 내부 검증(n=104) 및 외부 검증(n=111) 그룹에서 독립적으로 전체 대사체 분석을 추가로 수행했습니다. 결과적으로, 발견 세트에서 27개의 대사체가 가장 큰 평균 AUC 값을 갖는 최적의 판별 모델로 확인되었으며(그림 2b), 이 중 9개는 BN에 비해 LA에서 활성이 증가했고 18개는 활성이 감소했습니다(그림 2c).
폐결절 분류기 구축 워크플로우. 10겹 교차 검증을 통해 이진 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 탐색 세트에서 최적의 혈청 대사체 패널을 선택하고 내부 및 외부 검증 세트에서 예측 성능을 평가하는 과정을 포함합니다. b 대사 바이오마커 선택을 위한 LASSO 회귀 모델의 교차 검증 통계. 위의 숫자는 주어진 λ에서 선택된 바이오마커의 평균 개수를 나타냅니다. 빨간색 점선은 해당 λ에서의 평균 AUC 값을 나타냅니다. 회색 오차 막대는 최소 및 최대 AUC 값을 나타냅니다. 점선은 선택된 27개의 바이오마커를 사용한 최적 모델을 나타냅니다. AUC는 수신자 작동 특성(ROC) 곡선 아래 면적입니다. c 탐색 그룹에서 BN 그룹과 비교하여 LA 그룹에서 선택된 27개 대사체의 변화율. 빨간색 막대는 활성화, 파란색 막대는 감소를 나타냅니다. 그림 d–f는 발견, 내부 및 외부 검증 세트에서 27가지 대사체 조합을 기반으로 한 판별 모델의 성능을 보여주는 수신자 작동 특성(ROC) 곡선입니다. 원본 데이터는 소스 데이터 파일 형태로 제공됩니다.
이 27개 대사물질의 가중 회귀 계수를 기반으로 예측 모델을 구축했습니다(보충표 3). 이 27개 대사물질을 기반으로 한 ROC 분석 결과, AUC 값은 0.933, 탐색 그룹의 민감도는 0.868, 특이도는 0.859였습니다(그림 2d). 한편, LA와 HC 간에 주석이 달린 38개의 차등 대사물질 중 16개 대사물질 세트는 LA와 HC를 구별하는 데 있어 AUC 0.902, 민감도 0.801, 특이도 0.856을 달성했습니다(보충 그림 6a-c). 차등 대사물질에 대한 다양한 배율 변화 임계값을 기반으로 한 AUC 값도 비교했습니다. 배율 변화 수준을 1.5 또는 2.0보다 1.2로 설정했을 때 분류 모델이 LA와 BN(HC)을 구별하는 데 가장 우수한 성능을 보였습니다(보충 그림 7a,b). 27개 대사체 그룹을 기반으로 한 분류 모델은 내부 및 외부 코호트에서 추가 검증되었습니다. 내부 검증에서 AUC는 0.915(민감도 0.867, 특이도 0.811), 외부 검증에서 AUC는 0.945(민감도 0.810, 특이도 0.979)였습니다(그림 2e, f). 실험실 간 효율성을 평가하기 위해 외부 코호트의 40개 샘플을 방법 섹션에 설명된 대로 외부 실험실에서 분석했습니다. 분류 정확도는 AUC 0.925를 달성했습니다(보충 그림 8). 폐 편평 세포 암종(LUSC)은 폐 선암(LUAD) 다음으로 비소세포 폐암(NSCLC)의 두 번째로 흔한 아형이므로, 검증된 대사 프로파일의 잠재적 유용성도 테스트했습니다. BN 16례와 LUSC 16례를 사용했습니다. LUSC와 BN 간의 판별 AUC는 0.776이었으며(보충 그림 9), 이는 LUAD와 BN 간의 판별 능력에 비해 판별 능력이 떨어지는 것을 나타냅니다.
연구 결과에 따르면 CT 영상에서 결절의 크기는 악성 가능성과 양의 상관관계를 가지며, 결절 치료의 주요 결정 요인으로 작용합니다.25,26,27 대규모 NELSON 스크리닝 연구 코호트 데이터 분석 결과, 결절 크기가 5mm 미만인 대상자의 악성 위험도는 결절이 없는 대상자와 유사한 것으로 나타났습니다.28 따라서 영국 흉부학회(BTS)에서는 정기적인 CT 모니터링이 필요한 최소 크기를 5mm로, 플라이슈너 학회에서는 6mm로 권장하고 있습니다.29 그러나 6mm보다 크고 명확한 양성 특징이 없는 결절, 즉 불확정 폐결절(IPN)은 임상 현장에서 평가 및 관리에 있어 여전히 큰 어려움을 야기합니다.30,31 다음으로, 본 연구에서는 발견 코호트와 내부 검증 코호트의 통합 샘플을 사용하여 결절 크기가 대사체 특징에 영향을 미치는지 조사했습니다. 검증된 27개의 바이오마커에 초점을 맞춰, 먼저 HC와 BN의 6mm 미만 결절 대사체에 대한 PCA 프로파일을 비교했습니다. HC와 BN의 데이터 포인트 대부분이 겹치는 것을 확인했으며, 이는 두 그룹의 혈청 대사물질 수준이 유사함을 보여줍니다(그림 3a). 다양한 크기 범위에 걸친 특징 맵은 BN과 LA에서 보존되었지만(그림 3b, c), 6~20mm 범위에서는 악성 결절과 양성 결절이 분리되는 것이 관찰되었습니다(그림 3d). 이 코호트는 6~20mm 크기의 결절 악성도를 예측하는 데 있어 AUC 0.927, 특이도 0.868, 민감도 0.820을 나타냈습니다(그림 3e, f). 이러한 결과는 분류기가 결절 크기에 관계없이 초기 악성 변형으로 인한 대사 변화를 포착할 수 있음을 보여줍니다.
a 27개 대사물질의 대사 분류기를 기반으로 특정 그룹 간의 PCA 프로파일 비교. c CC 및 BN < 6 mm. b BN < 6 mm 대 BN 6–20 mm. c LA 6–20 mm 대 LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm 및 LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e 6–20 mm 결절에 대한 판별 모델 성능을 보여주는 수신자 작동 특성(ROC) 곡선. f 6–20 mm 크기의 결절에 대한 로지스틱 회귀 모델을 기반으로 확률값을 계산했습니다. 회색 점선은 최적의 절단값(0.455)을 나타냅니다. 위의 숫자는 로스앤젤레스에서 예측된 사례의 백분율을 나타냅니다. 양측 검정 스튜던트 t 검정을 사용하십시오. PCA는 주성분 분석입니다. AUC는 곡선 아래 면적입니다. 원본 데이터는 소스 데이터 파일 형태로 제공됩니다.
유사한 폐결절 크기(7~9mm)를 가진 4개의 샘플(44~61세)을 추가로 선택하여 제안된 악성 예측 모델의 성능을 설명했습니다(그림 4a, b). 초기 선별에서 사례 1은 양성 소견과 관련된 석회화를 동반한 고형 결절로 나타났고, 사례 2는 명확한 양성 특징이 없는 불확정적인 부분 고형 결절로 나타났습니다. 3차례의 추적 CT 촬영 결과, 이 두 사례는 4년 동안 안정적인 상태를 유지하여 양성 결절로 간주되었습니다(그림 4a). 연속 CT 촬영에 대한 임상 평가와 비교했을 때, 본 분류 모델을 사용한 단일 시점 혈청 대사체 분석은 확률적 제약 조건에 기반하여 이러한 양성 결절을 신속하고 정확하게 식별했습니다(표 1). 사례 3의 그림 4b는 흉막 수축 징후를 보이는 결절을 보여주는데, 이는 악성 종양과 가장 흔하게 연관되는 소견입니다.32 증례 4는 양성 원인의 증거가 없는 불확실한 부분 고형 결절로 나타났습니다. 이러한 모든 증례는 분류 모델에 따라 악성으로 예측되었습니다(표 1). 폐 절제술 후 조직병리학적 검사를 통해 폐선암으로 진단되었습니다(그림 4b). 외부 검증 세트에서 대사 분류기는 6mm보다 큰 불확실한 폐 결절 2례를 정확하게 예측했습니다(보충 그림 10).
두 양성 결절 환자의 폐 CT 영상(축상면). 1번 환자의 경우, 4년 후 CT 촬영에서 우측 하엽에 석회화를 동반한 7mm 크기의 안정적인 고형 결절이 관찰되었다. 2번 환자의 경우, 5년 후 CT 촬영에서 우측 상엽에 직경 7mm의 안정적인 부분 고형 결절이 확인되었다. b 1기 선암 두 환자의 폐 절제술 전 CT 영상(축상면) 및 병리 조직 검사 소견. 3번 환자의 경우, 우측 상엽에 흉막 함몰을 동반한 직경 8mm 크기의 결절이 관찰되었다. 4번 환자의 경우, 좌측 상엽에 직경 9mm의 부분 고형 유리음영 결절이 관찰되었다. 절제된 폐 조직의 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색 소견(척도 막대 = 50μm)에서 폐 선암의 소엽상 성장 양상이 나타났다. 화살표는 CT 영상에서 관찰된 결절을 가리킨다. H&E 염색 이미지는 병리학자가 검사한 여러 (>3) 현미경 시야를 대표하는 이미지입니다.
종합적으로 볼 때, 우리의 연구 결과는 CT 스크리닝 평가 시 어려움을 야기할 수 있는 폐결절의 감별 진단에 있어 혈청 대사물질 바이오마커의 잠재적 가치를 보여줍니다.
검증된 차등 대사체 패널을 기반으로 주요 대사 변화의 생물학적 상관관계를 규명하고자 했습니다. MetaboAnalyst를 이용한 KEGG 경로 농축 분석 결과, 두 그룹(LA vs. HC 및 LA vs. BN, 조정 p ≤ 0.001, 효과 > 0.01) 간에 유의미하게 변화된 6개의 공통 경로가 확인되었습니다. 이러한 변화는 피루브산 대사, 트립토판 대사, 니아신 및 니코틴아미드 대사, 해당 과정, TCA 회로, 퓨린 대사의 교란으로 특징지어졌습니다(그림 5a). 이후, 절대 정량을 통해 주요 변화를 검증하기 위해 표적 대사체학 분석을 추가로 수행했습니다. 공통적으로 변화된 경로의 공통 대사체는 표준 대사체를 사용하여 삼중 사중극자 질량 분석기(QQQ)로 측정했습니다. 대사체학 연구 대상 표본의 인구통계학적 특성은 보충표 4에 포함되어 있습니다. 전반적인 대사체학 결과와 일관되게, 정량 분석 결과 LA 그룹에서 BN 및 HC 그룹에 비해 히포크산틴, 크산틴, 피루브산, 젖산이 증가한 것으로 확인되었습니다(그림 5b, c, p <0.05). 그러나 BN과 HC 그룹 간에는 이러한 대사물질에서 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다.
LA 그룹과 BN 및 HC 그룹 간에 유의미하게 차이가 나는 대사물질에 대한 KEGG 경로 농축 분석. 양측 검정 Globaltest를 사용하였고, p값은 Holm-Bonferroni 방법을 사용하여 조정하였다(조정된 p ≤ 0.001, 효과 크기 > 0.01). b–d LC-MS/MS로 측정한 HC, BN, LA 그룹의 혈청 내 하이포크산틴, 크산틴, 젖산, 피루브산, 트립토판 수치를 보여주는 바이올린 플롯(그룹당 n=70). 흰색 점선과 검은색 점선은 각각 중앙값과 사분위수를 나타낸다. e LUAD-TCGA 데이터 세트에서 정상 폐 조직(n=59)과 비교하여 폐선암(n=513)에서 SLC7A5 및 QPRT mRNA 발현량을 Log2TPM(백만당 전사체 수)으로 정규화한 값을 보여주는 바이올린 플롯. 흰색 상자는 사분위 범위(IQR)를 나타내고, 중앙의 가로 검은색 선은 중앙값을 나타내며, 상자에서 뻗어 나온 세로 검은색 선은 95% 신뢰구간(CI)을 나타냅니다. f TCGA 데이터 세트에서 폐선암(n = 513)과 정상 폐 조직(n = 59)의 SLC7A5 및 GAPDH 발현에 대한 피어슨 상관 관계 플롯. 회색 영역은 95% CI를 나타냅니다. r은 피어슨 상관 계수입니다. g 비특이적 shRNA 대조군(NC) 및 shSLC7A5(Sh1, Sh2)를 transfection한 A549 세포에서 LC-MS/MS로 측정한 정규화된 세포 트립토판 수준. 각 그룹에서 생물학적으로 독립적인 5개 샘플에 대한 통계 분석 결과가 제시됩니다. h A549 세포(NC)와 SLC7A5 knockdown A549 세포(Sh1, Sh2)에서 NADt(NAD+ 및 NADH를 포함한 총 NAD) 수준. 각 그룹에서 생물학적으로 독립적인 세 개의 샘플에 대한 통계 분석 결과를 제시합니다. i SLC7A5 녹다운 전후의 A549 세포의 해당 활성은 세포외 산성화율(ECAR)로 측정했습니다(그룹당 생물학적으로 독립적인 샘플 4개). 2-DG,2-데옥시-D-글루코스. (b–h)에서는 양측 스튜던트 t 검정을 사용했습니다. (g–i)에서 오차 막대는 평균 ± 표준편차를 나타내며, 각 실험은 세 번 독립적으로 수행되었고 결과는 유사했습니다. 원본 데이터는 소스 데이터 파일 형태로 제공됩니다.
LA 그룹에서 트립토판 대사 변화가 미치는 중요한 영향을 고려하여, QQQ 방법을 사용하여 HC, BN 및 LA 그룹의 혈청 트립토판 수치를 측정했습니다. 그 결과, LA 그룹의 혈청 트립토판 수치가 HC 또는 BN 그룹에 비해 유의하게 감소한 것을 확인했습니다(p < 0.001, 그림 5d). 이는 폐암 환자의 혈중 트립토판 수치가 대조군에 비해 낮다는 기존 연구 결과와 일치합니다.33,34,35 또한, PET/CT 추적자인 11C-메틸-L-트립토판을 사용한 연구에서는 폐암 조직의 트립토판 신호 유지 시간이 양성 병변이나 정상 조직에 비해 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다.36 따라서 LA 그룹 혈청에서 트립토판 수치가 감소한 것은 폐암 세포에 의한 활발한 트립토판 흡수를 반영하는 것일 수 있다고 추측합니다.
또한, 트립토판 이화작용의 키누레닌 경로의 최종 산물은 NAD+37,38이며, 이는 해당과정에서 글리세르알데히드-3-인산과 1,3-비스포스포글리세레이트의 반응에 중요한 기질이라는 것도 알려져 있습니다39. 이전 연구들은 면역 조절에서 트립토판 이화작용의 역할에 초점을 맞추었지만, 본 연구에서는 트립토판 조절 이상과 해당 경로 간의 상호작용을 규명하고자 했습니다. 용질 수송체 패밀리 7 멤버 5(SLC7A5)는 트립토판 수송체로 알려져 있습니다43,44,45. 퀴놀린산 포스포리보실트랜스퍼라제(QPRT)는 키누레닌 경로 하류에 위치한 효소로, 퀴놀린산을 NAMN으로 전환합니다46. LUAD TCGA 데이터 세트를 분석한 결과, SLC7A5와 QPRT 모두 정상 조직에 비해 종양 조직에서 유의하게 상향 조절된 것을 확인했습니다(그림 5e). 이러한 증가는 폐선암의 1기 및 2기뿐만 아니라 3기 및 4기에서도 관찰되었으며(보충 그림 11), 이는 종양 발생과 관련된 트립토판 대사의 초기 교란을 나타냅니다.
또한, LUAD-TCGA 데이터 세트는 암 환자 샘플에서 SLC7A5와 GAPDH mRNA 발현 사이에 양의 상관관계(r = 0.45, p = 1.55E-26, 그림 5f)를 보여주었습니다. 대조적으로, 정상 폐 조직에서는 이러한 유전자 발현 양상 사이에 유의미한 상관관계가 발견되지 않았습니다(r = 0.25, p = 0.06, 그림 5f). A549 세포에서 SLC7A5를 억제(보충 그림 12)하면 세포 내 트립토판 및 NAD(H) 수준이 유의하게 감소하여(그림 5g,h), 세포외 산성화율(ECAR)로 측정된 해당 작용 활성이 약화되었습니다(그림 5i). 따라서 혈청 및 시험관 내 검출을 통한 대사 변화를 바탕으로, 트립토판 대사가 키누레닌 경로를 통해 NAD+를 생성하고 폐암에서 해당 작용을 촉진하는 데 중요한 역할을 할 수 있다는 가설을 세웠습니다.
연구에 따르면 LDCT로 발견된 다수의 불확실한 폐결절은 PET-CT, 폐 생검과 같은 추가 검사의 필요성을 야기하고 악성으로 오진하여 과잉 치료로 이어질 수 있습니다.31 그림 6에서 볼 수 있듯이, 본 연구에서는 CT로 발견된 폐결절의 위험 계층화 및 후속 관리를 개선할 수 있는 잠재적 진단 가치를 지닌 혈청 대사물질 패널을 확인했습니다.
폐결절은 저선량 컴퓨터 단층촬영(LDCT)을 이용하여 평가하며, 영상 소견은 양성 또는 악성 여부를 시사합니다. 결절의 불확실한 예후로 인해 잦은 추적 관찰, 불필요한 시술 및 과잉 치료가 발생할 수 있습니다. 진단적 가치가 있는 혈청 대사 분류자를 포함시키면 폐결절의 위험 평가 및 후속 관리를 개선할 수 있습니다. PET(양전자 방출 단층촬영)
미국 NLST 연구와 유럽 NELSON 연구의 데이터는 저선량 컴퓨터 단층촬영(LDCT)을 이용한 고위험군 선별검사가 폐암 사망률을 감소시킬 수 있음을 시사합니다.1,3 그러나 LDCT로 우연히 발견된 다수의 폐결절에 대한 위험 평가 및 후속 임상 관리는 여전히 가장 어려운 과제입니다. 본 연구의 주요 목표는 신뢰할 수 있는 바이오마커를 통합하여 기존 LDCT 기반 프로토콜의 정확한 분류를 최적화하는 것입니다.
폐암 환자와 건강한 대조군을 비교함으로써 혈액 대사물질과 같은 특정 분자 바이오마커가 확인되었습니다.15,17 본 연구에서는 저선량 CT(LDCT)에서 우연히 발견된 양성 및 악성 폐결절을 구별하기 위해 혈청 대사체 분석을 적용하는 데 초점을 맞추었습니다. UPLC-HRMS 분석을 사용하여 건강한 대조군(HC), 양성 폐결절(BN) 및 1기 폐선암(LA) 샘플의 전체 혈청 대사체를 비교했습니다. HC와 BN은 유사한 대사 프로파일을 보인 반면, LA는 HC 및 BN에 비해 유의미한 변화를 나타냈습니다. LA를 HC 및 BN과 구별하는 두 가지 혈청 대사물질 세트를 확인했습니다.
현재 양성 및 악성 결절을 식별하는 저선량 CT(LDCT) 기반 방법은 주로 결절의 크기, 밀도, 형태 및 시간 경과에 따른 성장 속도에 기반합니다.30 이전 연구에 따르면 결절의 크기는 폐암 발생 가능성과 밀접한 관련이 있습니다. 고위험 환자에서도 6mm 미만 결절의 악성 위험은 1% 미만입니다. 6~20mm 크기의 결절의 악성 위험은 8%에서 64%에 이릅니다.30 따라서 플라이슈너 학회(Fleischner Society)는 일상적인 CT 추적 관찰을 위한 결절 직경 기준치를 6mm로 권장합니다.29 그러나 6mm보다 큰 불확정 폐결절(IPN)의 위험 평가 및 관리는 아직 충분히 이루어지지 않았습니다.31 선천성 심장 질환의 현재 관리는 일반적으로 빈번한 CT 모니터링을 통한 경과 관찰에 기반합니다.
검증된 대사체 데이터를 기반으로, 우리는 건강한 사람과 6mm 미만의 양성 결절 사이의 대사체 특징이 중복됨을 처음으로 입증했습니다. 이러한 생물학적 유사성은 6mm 미만 결절의 악성 위험이 결절이 없는 사람과 마찬가지로 낮다는 기존 CT 연구 결과와 일치합니다.30 또한, 우리의 결과는 6mm 미만 및 6mm 이상의 양성 결절이 대사체 프로파일에서 높은 유사성을 보임을 보여주며, 이는 결절 크기에 관계없이 양성 병인의 기능적 정의가 일관적임을 시사합니다. 따라서, 최신 진단용 혈청 대사체 패널은 CT에서 결절이 처음 발견되었을 때 단일 검사로 악성 여부를 배제할 수 있으며, 잠재적으로 연속적인 모니터링을 줄일 수 있습니다. 동시에, 동일한 대사 바이오마커 패널은 6mm 이상의 악성 결절을 양성 결절과 구별하고, CT 영상에서 형태학적 특징이 모호하고 크기가 유사한 IPN(종양성 신생물)에 대한 정확한 예측을 제공했습니다. 이 혈청 대사 분류기는 AUC 0.927로 6mm 이상 결절의 악성도를 예측하는 데 우수한 성능을 보였습니다. 종합적으로, 본 연구 결과는 고유한 혈청 대사체 특징이 종양 초기 단계에서 발생하는 대사 변화를 특이적으로 반영하며, 결절 크기와 무관하게 위험 예측 인자로서 잠재적 가치가 있음을 시사합니다.
특히, 폐선암(LUAD)과 편평세포암(LUSC)은 비소세포폐암(NSCLC)의 주요 유형입니다. LUSC는 흡연과 밀접한 관련이 있고47, LUAD는 CT 스크리닝에서 우연히 발견되는 폐결절의 가장 흔한 조직학적 유형이라는 점을 고려하여48, 본 분류 모델은 1기 폐선암 샘플에 특화하여 개발되었습니다. Wang 등은 LUAD에 초점을 맞춰 지질체학을 이용하여 초기 단계 폐암 환자와 건강한 사람을 구별하는 9가지 지질 특징을 확인했습니다17. 본 연구에서는 16건의 1기 LUSC 사례와 74건의 양성 결절에 대해 본 분류 모델을 테스트한 결과, LUSC 예측 정확도가 낮게 나타났습니다(AUC 0.776). 이는 LUAD와 LUSC가 각각 고유한 대사체학적 특징을 가질 수 있음을 시사합니다. 실제로 LUAD와 LUSC는 병인, 생물학적 기원 및 유전적 이상이 서로 다른 것으로 알려져 있습니다49. 따라서, 선별 검사 프로그램에서 인구 기반 폐암 발견을 위한 훈련 모델에는 다른 유형의 조직학적 검사법도 포함되어야 합니다.
본 연구에서는 건강한 대조군 및 양성 결절과 비교하여 폐선암에서 가장 빈번하게 변화된 6가지 대사 경로를 확인했습니다. 크산틴과 하이포크산틴은 퓨린 대사 경로의 일반적인 대사 산물입니다. 본 연구 결과와 일관되게, 퓨린 대사와 관련된 중간체들은 건강한 대조군 또는 전암 단계 환자와 비교하여 폐선암 환자의 혈청 또는 조직에서 유의하게 증가했습니다.15,50 혈청 크산틴 및 하이포크산틴 수치의 증가는 빠르게 증식하는 암세포에 필요한 동화 작용을 반영하는 것일 수 있습니다. 포도당 대사의 조절 장애는 암 대사의 잘 알려진 특징입니다.51 본 연구에서는 폐선암(LA) 그룹에서 건강한 대조군(HC) 및 양성 결절(BN) 그룹에 비해 피루브산과 젖산이 유의하게 증가한 것을 관찰했으며, 이는 비소세포폐암(NSCLC) 환자와 건강한 대조군의 혈청 대사체 프로필에서 해당 경로 이상을 보고한 이전 연구 결과와 일치합니다.52,53
중요하게도, 우리는 폐선암 환자의 혈청에서 피루브산과 트립토판 대사 사이에 역상관 관계가 있음을 관찰했습니다. LA 그룹의 혈청 트립토판 수치는 HC 또는 BN 그룹에 비해 감소했습니다. 흥미롭게도, 이전의 대규모 전향적 코호트 연구에서는 혈중 트립토판 수치가 낮을수록 폐암 위험이 증가한다는 결과가 나왔습니다.54 트립토판은 우리가 전적으로 음식에서 섭취하는 필수 아미노산입니다. 따라서 폐선암에서 혈청 트립토판 감소는 이 대사산물의 급격한 감소를 반영하는 것일 수 있다고 결론지었습니다. 키누레닌 경로를 통한 트립토판 이화작용의 최종 산물이 새로운 NAD+ 합성의 원천이라는 것은 잘 알려져 있습니다. NAD+는 주로 회수 경로를 통해 생성되기 때문에 건강과 질병에서 트립토판 대사에 있어 NAD+의 중요성은 아직 규명되지 않았습니다.46 TCGA 데이터베이스 분석 결과, 폐선암에서 트립토판 수송체인 용질 수송체 7A5(SLC7A5)의 발현이 정상 대조군에 비해 유의하게 증가했으며, 해당 효소인 GAPDH의 발현과 양의 상관관계를 보였습니다. 이전 연구들은 주로 트립토판 대사가 항종양 면역 반응 억제에 미치는 역할에 초점을 맞추었습니다.40,41,42 본 연구에서는 폐암 세포에서 SLC7A5를 억제하여 트립토판 흡수를 저해하면 세포 내 NAD 수준이 감소하고 이에 따라 해당 활성도 저하됨을 보여줍니다. 요컨대, 본 연구는 폐선암의 악성 전환과 관련된 혈청 대사 변화에 대한 생물학적 근거를 제시합니다.
EGFR 돌연변이는 비소세포폐암(NSCLC) 환자에서 가장 흔한 유전자 돌연변이입니다. 본 연구에서 EGFR 돌연변이 환자(n=41)는 EGFR 야생형 환자(n=31)와 전반적인 대사체 프로파일이 유사했지만, 일부 EGFR 돌연변이 환자에서는 아실카르니틴의 혈청 수치가 감소한 것을 확인했습니다. 아실카르니틴은 세포질에서 미토콘드리아 기질로 아실기를 운반하여 지방산 산화를 통해 에너지를 생성하는 기능을 하는 것으로 알려져 있습니다.55 최근 연구에서도 102개의 폐선암 조직 샘플의 전체 대사체를 분석하여 EGFR 돌연변이 종양과 EGFR 야생형 종양 간에 유사한 대사체 프로파일이 확인되었다는 결과가 본 연구 결과와 일치합니다.50 흥미롭게도 EGFR 돌연변이 그룹에서도 아실카르니틴 함량이 높게 나타났습니다. 따라서 아실카르니틴 수치의 변화가 EGFR 유도 대사 변화를 반영하는지, 그리고 그 기저에 있는 분자 경로에 대해서는 추가 연구가 필요합니다.
결론적으로, 본 연구는 폐결절의 감별 진단을 위한 혈청 대사 분류기를 확립하고, CT 스캔 스크리닝을 기반으로 위험 평가를 최적화하고 임상 관리를 용이하게 하는 워크플로우를 제안합니다.
본 연구는 쑨얏센대학교 암병원 윤리위원회, 쑨얏센대학교 제1부속병원 윤리위원회, 그리고 정저우대학교 암병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 탐색 및 내부 검증 그룹에서는 쑨얏센대학교 암센터 암관리예방과에서 연례 건강검진을 받는 건강한 사람 174명의 혈청과 양성 결절 환자 244명의 혈청을 수집했습니다. 외부 검증 코호트에서는 쑨얏센대학교 제1부속병원에서 수집한 양성 결절 환자 48명과 1기 폐선암 환자 39명, 그리고 정저우대학교 암병원에서 수집한 1기 폐선암 환자 24명을 포함했습니다. 쑨얏센대학교 암센터는 또한 확립된 대사 분류기의 진단 능력을 검증하기 위해 1기 편평세포 폐암 환자 16례를 수집했습니다(환자 특성은 부록 표 5 참조). 탐색 코호트와 내부 검증 코호트의 샘플은 2018년 1월부터 2020년 5월까지 수집되었으며, 외부 검증 코호트의 샘플은 2021년 8월부터 2022년 10월까지 수집되었습니다. 성별 편향을 최소화하기 위해 각 코호트에 남녀 환자 수를 거의 동일하게 배정했습니다. 탐색팀과 내부 검토팀이 참여했습니다. 참가자의 성별은 자가 보고를 기반으로 확인했습니다. 모든 참가자로부터 사전 동의를 받았으며, 어떠한 보상도 제공되지 않았습니다. 양성 결절은 분석 시점에서 2~5년 동안 CT 스캔 점수가 안정적인 환자로 정의했으며, 외부 검증 샘플의 1례는 수술 전 채취하여 조직병리학적으로 진단한 경우를 제외했습니다. 만성 기관지염을 제외하고, 폐선암 사례는 폐 절제술 전에 채취하여 병리학적 진단으로 확진했습니다. 공복 혈액 샘플을 항응고제가 없는 혈청 분리 튜브에 채취했습니다. 혈액 샘플은 실온에서 1시간 동안 응고시킨 후 4°C에서 2851 × g로 10분간 원심분리하여 혈청 상층액을 얻었습니다. 혈청 분획은 대사물질 추출 전까지 -80°C에서 냉동 보관했습니다. 쑨얏센대학교 암센터 암예방 및 건강검진과는 40~55세 남녀 각각 100명씩 총 100명의 건강한 기증자로부터 혈청을 채취하여 혼합했습니다. 각 기증자의 혈청 샘플을 동일한 양으로 혼합한 후, 이를 분획하여 -80°C에서 보관했습니다. 이 혈청 혼합물은 품질 관리 및 데이터 표준화를 위한 기준 물질로 사용되었습니다.
기준 혈청과 시험 샘플을 해동한 후, 복합 추출법(MTBE/메탄올/물)을 이용하여 대사산물을 추출하였다.56 간단히 설명하면, 혈청 50 μl를 얼음처럼 차가운 메탄올 225 μl와 얼음처럼 차가운 메틸 tert-부틸 에테르(MTBE) 750 μl와 혼합하였다. 혼합물을 저어준 후 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음 샘플을 혼합하고 내부 표준물질(Cambridge Isotope Laboratories에서 구입한 13C-젖산, 13C3-피루브산, 13C-메티오닌 및 13C6-이소류신)이 포함된 MS 등급 증류수 188 μl를 첨가하여 와류 혼합하였다. 혼합물을 4 °C에서 10분 동안 15,000 × g로 원심분리하고, 하층을 두 개의 튜브(각 125 μL)에 옮겨 양성 및 음성 모드에서 LC-MS 분석을 수행하였다. 마지막으로, 시료를 고속 진공 농축기에서 완전히 건조시켰다.
건조된 대사산물을 80% 아세토니트릴 120 μl에 재용해하고, 5분간 와류시킨 후, 4°C에서 15,000 × g로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 대사체학 연구를 위해 마이크로인서트가 있는 갈색 유리병에 옮겼다. 초고성능 액체 크로마토그래피-고해상도 질량 분석기(UPLC-HRMS) 플랫폼을 이용한 비표적 대사체학 분석을 수행하였다. 대사산물은 Dionex Ultimate 3000 UPLC 시스템과 ACQUITY BEH Amide 컬럼(2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters)을 사용하여 분리하였다. 양이온 모드에서 이동상은 95% (A)와 50% 아세토니트릴 (B)이었으며, 각 용액에는 10 mmol/L 아세트산암모늄과 0.1% 포름산이 함유되어 있었다. 음이온 모드에서 이동상 A와 B는 각각 95%와 50%의 아세토니트릴을 함유했으며, 두 상 모두 10mmol/L 아세트산암모늄을 첨가하여 pH 9로 조절하였다. 그라디언트 프로그램은 다음과 같다: 0–0.5분, 2% B; 0.5–12분, 2–50% B; 12–14분, 50–98% B; 14–16분, 98% B; 16–16.1분, 98–2% B; 16.1–20분, 2% B. 컬럼 온도는 40°C, 시료 온도는 자동 시료 주입기 내에서 10°C로 유지하였다. 유속은 0.3ml/min, 주입량은 3μl였다. 전기분무 이온화(ESI) 소스가 장착된 Q-Exactive Orbitrap 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)를 풀 스캔 모드로 작동시키고 ddMS2 모니터링 모드를 사용하여 대용량 데이터를 수집했습니다. 질량 분석기 매개변수는 다음과 같이 설정했습니다: 분무 전압 +3.8 kV/- 3.2 kV, 모세관 온도 320°C, 차폐 가스 40 arb, 보조 가스 10 arb, 프로브 히터 온도 350°C, 스캔 범위 70–1050 m/h, 분해능 70,000. 데이터는 Xcalibur 4.1(Thermo Fisher Scientific) 소프트웨어를 사용하여 수집했습니다.
데이터 품질을 평가하기 위해 각 샘플의 상층액에서 10μL씩을 취하여 풀링된 품질 관리(QC) 샘플을 생성했습니다. UPLC-MS 시스템의 안정성을 평가하기 위해 분석 과정 초기에 6개의 품질 관리 샘플을 주입하여 분석했습니다. 이후 배치에 주기적으로 품질 관리 샘플을 추가했습니다. 본 연구의 모든 11개 배치 혈청 샘플을 LC-MS로 분석했습니다. 추출 과정을 모니터링하고 배치 간 영향을 보정하기 위해 각 배치에서 건강한 공여자 100명의 혈청 풀링 혼합물을 참조 물질로 사용했습니다. 발견 코호트, 내부 검증 코호트 및 외부 검증 코호트의 비표적 대사체 분석은 쑨얏센대학교 대사체 센터에서 수행했습니다. 광둥공업대학교 분석시험센터의 외부 연구실에서도 분류기 모델의 성능을 검증하기 위해 외부 코호트의 샘플 40개를 분석했습니다.
추출 및 재구성 후, 혈청 대사산물의 절대 정량은 전기분무 이온화(ESI) 소스를 사용하는 초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석기(Agilent 6495 트리플 쿼드루폴)를 이용하여 다중 반응 모니터링(MRM) 모드로 측정하였다. 대사산물 분리에는 ACQUITY BEH Amide 컬럼(2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters)을 사용하였다. 이동상은 10 mmol/L 아세트산암모늄과 0.1% 암모니아 용액을 첨가한 90%(A)와 5% 아세토니트릴(B)로 구성하였다. 그라디언트 프로그램은 다음과 같다: 0–1.5분, 0% B; 1.5–6.5분, 0–15% B; 6.5–8분, 15% B; 8–8.5분, 15%–0% B; 8.5–11.5분, 0% B. 컬럼 온도는 40°C, 시료 온도는 자동 시료 주입기에서 10°C로 유지하였다. 유속은 0.3 mL/min, 주입량은 1 μL였다. MS 매개변수는 다음과 같이 설정하였다: 모세관 전압 ±3.5 kV, 분무기 압력 35 psi, 쉬스 가스 유량 12 L/min, 쉬스 가스 온도 350°C, 건조 가스 온도 250°C, 건조 가스 유량 14 L/min. 트립토판, 피루브산, 젖산, 히포크산틴, 크산틴의 MRM 전환율은 각각 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3, 151.0–107.9였다. 데이터는 Mass Hunter B.07.00(Agilent Technologies)을 사용하여 수집하였다. 혈청 시료의 경우, 트립토판, 피루브산, 젖산, 히포크산틴 및 크산틴은 표준 혼합 용액의 검량 곡선을 이용하여 정량하였다. 세포 시료의 경우, 트립토판 함량은 내부 표준 물질 및 세포 단백질 질량으로 정규화하였다.
피크 추출(m/z 및 유지 시간(RT))은 Compound Discovery 3.1 및 TraceFinder 4.0(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행되었습니다. 배치 간의 잠재적 차이를 제거하기 위해, 테스트 샘플의 각 특징적인 피크를 동일 배치의 참조 물질의 특징적인 피크로 나누어 상대적 존재량을 구했습니다. 표준화 전후의 내부 표준 물질의 상대 표준 편차는 보충표 6에 나와 있습니다. 두 그룹 간의 차이는 위양성 발견율(FDR<0.05, Wilcoxon 부호 순위 검정)과 배율 변화(>1.2 또는 <0.83)로 특징지었습니다. 추출된 특징의 원시 MS 데이터와 참조 혈청 보정 MS 데이터는 각각 보충 자료 1과 보충 자료 2에 나와 있습니다. 피크 주석은 식별된 대사 산물, 추정 주석 화합물, 추정 특성 화합물 클래스 및 미지의 화합물을 포함한 네 가지 정의된 식별 수준을 기반으로 수행되었습니다.22 Compound Discovery 3.1(mzCloud, HMDB, Chemspider) 데이터베이스 검색을 기반으로, mzCloud(점수 > 85) 또는 Chemspider에서 검증된 표준 물질과 MS/MS 일치 또는 정확한 일치 주석이 있는 생물학적 화합물을 차등 대사체 간의 중간체로 최종 선정했습니다. 각 특징에 대한 피크 주석은 보충 자료 3에 포함되어 있습니다. MetaboAnalyst 5.0을 사용하여 합으로 정규화된 대사체 풍부도의 단변량 분석을 수행했습니다. 또한 MetaboAnalyst 5.0은 유의미하게 차이가 나는 대사체를 기반으로 KEGG 경로 농축 분석을 수행했습니다. 주성분 분석(PCA)과 부분 최소 제곱 판별 분석(PLS-DA)은 ropls 소프트웨어 패키지(v.1.26.4)를 사용하여 스택 정규화 및 자동 스케일링을 적용하여 분석했습니다. 결절 악성도를 예측하기 위한 최적의 대사체 바이오마커 모델은 최소 절대 수축 및 선택 연산자(LASSO, R 패키지 v.4.1-3)를 사용한 이진 로지스틱 회귀 분석을 통해 생성했습니다. 판별 모델의 성능은 pROC 패키지(v.1.18.0)를 사용하여 ROC 분석 기반 AUC를 추정함으로써 평가했습니다. 최적의 확률 임계값은 모델의 유덴 지수(민감도 + 특이도 - 1)가 최대가 되는 값으로 설정했습니다. 이 임계값보다 작거나 큰 값을 가진 샘플은 각각 양성 결절과 폐선암으로 예측됩니다.
A549 세포(#CCL-185, American Type Culture Collection)는 10% FBS가 함유된 F-12K 배지에서 배양했습니다. SLC7A5를 표적으로 하는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 서열과 비표적 대조군(NC) 서열을 렌티바이러스 벡터 pLKO.1-puro에 삽입했습니다. shSLC7A5의 안티센스 서열은 다음과 같습니다: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5 항체(#5347)와 튜불린 항체(#2148)는 Cell Signaling Technology에서 구입했습니다. SLC7A5 및 튜불린 항체는 웨스턴 블롯 분석에 1:1000 희석액으로 사용했습니다.
Seahorse XF 해당분해 스트레스 테스트는 세포외 산성화(ECAR) 수준을 측정합니다. 이 테스트에서는 포도당, 올리고마이신 A, 2-DG를 순차적으로 투여하여 ECAR로 측정되는 세포의 해당분해 능력을 평가합니다.
비표적 대조군(NC) 및 shSLC7A5(Sh1, Sh2)로 형질전환된 A549 세포를 직경 10cm 배양 접시에 하룻밤 동안 배양했습니다. 세포 대사산물은 얼음처럼 차가운 80% 메탄올 수용액 1ml로 추출했습니다. 메탄올 용액에 있는 세포를 긁어내어 새 튜브에 옮긴 후 4°C에서 15분 동안 15,000 × g로 원심분리했습니다. 상층액 800µl를 수집하고 고속 진공 농축기를 사용하여 건조했습니다. 건조된 대사산물 펠렛은 앞서 설명한 LC-MS/MS 방법을 사용하여 트립토판 수준을 분석했습니다. A549 세포(NC 및 shSLC7A5)의 세포 내 NAD(H) 수준은 제조사의 지침에 따라 정량적 NAD+/NADH 비색 키트(#K337, BioVision)를 사용하여 측정했습니다. 각 샘플의 단백질 수준을 측정하여 대사산물의 양을 정규화했습니다.
표본 크기를 사전 결정하기 위해 통계적 방법은 사용하지 않았습니다. 바이오마커 발굴을 목표로 한 이전의 대사체학 연구들15,18을 표본 크기 결정의 기준으로 삼았으며, 이러한 연구들과 비교했을 때 본 연구의 표본 크기는 적절했습니다. 연구 코호트에서 제외된 표본은 없었습니다. 혈청 표본은 무작위로 발굴 그룹(306례, 74.6%)과 내부 검증 그룹(104례, 25.4%)으로 배정하여 비표적 대사체학 연구를 수행했습니다. 또한, 발굴 그룹에서 각 그룹별로 70례씩 무작위로 선정하여 표적 대사체학 연구에 사용했습니다. 연구자들은 LC-MS 데이터 수집 및 분석 과정에서 그룹 배정 정보를 알지 못하도록 했습니다. 대사체학 데이터 및 세포 실험에 대한 통계 분석은 각각의 결과, 그림 설명 및 방법 섹션에 기술되어 있습니다. 세포 내 트립토판, NADT 및 해당 과정 활성의 정량은 동일한 결과를 얻으며 세 번 독립적으로 수행되었습니다.
연구 설계에 대한 자세한 내용은 이 기사와 함께 제공되는 내추럴 포트폴리오 보고서 요약을 참조하십시오.
추출된 특징의 원시 MS 데이터와 참조 혈청의 정규화된 MS 데이터는 각각 보충 자료 1과 보충 자료 2에 제시되어 있습니다. 차별적으로 나타난 특징에 대한 피크 주석은 보충 자료 3에 제시되어 있습니다. LUAD TCGA 데이터 세트는 https://portal.gdc.cancer.gov/에서 다운로드할 수 있습니다. 그래프 작성에 사용된 입력 데이터는 소스 데이터에 포함되어 있습니다. 소스 데이터는 본 논문에 제공됩니다.
국립 폐암 검진 연구 그룹 등. 저선량 컴퓨터 단층 촬영을 이용한 폐암 사망률 감소. 북부 잉글랜드. 의학 저널. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR 및 Prophet, PC 저선량 나선형 CT를 이용한 폐암 검진: 전국 폐암 검진 연구(NLST) 결과. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
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게시 시간: 2023년 9월 18일